非洲农业生态系统中解淀粉芽孢杆菌（Bacillus velezensis）CIMT3 全基因组测序及其意义

《Microbiology Resource Announcements 0.7》：Complete genome sequence of Bacillus velezensis CIMT3, isolated from maize-cultivated soil

为探究非洲农业生态系统中解淀粉芽孢杆菌（B. velezensis）的基因组情况，研究人员从刚果民主共和国玉米种植土壤中分离出 CIMT3 菌株进行全基因组测序。结果显示其基因组含一条 4,242,144 bp 的染色体，GC 含量 46%，这为相关研究提供了重要数据。

　　本报告呈现了解淀粉芽孢杆菌（Bacillus velezensis）CIMT3 的完整基因组序列，该菌是一种广为人知的促进植物生长的细菌。此菌株的基因组由一条染色体构成，长度为 4,242,144 bp，GC 含量为 46%。解淀粉芽孢杆菌是革兰氏阳性、需氧的杆状细菌，广泛存在于各种环境中，包括土壤。它在土壤生态系统中因促进植物生长的特性而闻名。在全球范围内，虽然已分离并鉴定出众多解淀粉芽孢杆菌菌株，但针对来自非洲农业生态系统的菌株进行的基因组研究却很有限。在这项研究中，研究人员从刚果民主共和国卡巴雷（南纬 2°20′08″，东经 28°46′59″）种植玉米的土壤里分离出解淀粉芽孢杆菌 CIMT3 菌株。具体操作是，小心去除大块土壤后，收集紧密附着在 1 个月大玉米根上的根际土壤。简而言之，将 1.0 ± 0.1 g 均质化的土壤样品悬浮在 9.0 mL 无菌的 0.85%（wt/vol）氯化钠溶液中。随后，取 100 μL 该悬浮液涂布在马铃薯葡萄糖琼脂（美国 Difco 公司产品）平板上。分离出的单个菌落接着在马铃薯葡萄糖肉汤培养基中，于 30°C、200 rpm 振荡条件下培养 18 h。
用于全基因组测序的基因组 DNA 是使用美国 Promega 公司的 Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒，按照制造商的说明提取的。在进行全基因组测序之前，通过 16S rRNA 基因扩增进行分类学鉴定。聚合酶链式反应（PCR）使用通用细菌引物 27F（5′-AGAGTTTGATC^MTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR 条件如下：94°C 初始变性 5 分钟，然后进行 30 个循环，每个循环包括 94°C 变性 30 秒、55°C 退火 30 秒、72°C 延伸 1 分钟，最后 72°C 延伸 10 分钟。扩增的 PCR 产物在韩国首尔的 Macrogen 公司进行桑格测序（Sanger sequencing），序列提交到美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库，登录号为 PQ804475。分别使用美国 Invitrogen 公司的 Qubit 3.0 荧光计和美国赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific）的 NanoDrop One 分光光度计评估提取 DNA 的数量和质量。根据 Qubit 和 NanoDrop 测量结果，符合质量控制标准的 DNA 样品，无需事先剪切，就用于牛津纳米孔技术（ONT）测序。使用英国牛津 ONT 公司的连接测序试剂盒（SQK-LSK109）进行文库制备，且无需事先剪切，在配备 FLO-MIN111（R10.3）流动池的 MinION 设备上进行测序。长读长测序在韩国大邱的庆北国立大学（KNU）下一代测序（NGS）核心设施完成。测序数据的碱基识别使用 Guppy 软件（版本 4.4.1）的高精度模型，共产生 132,912 条读长，总长度为 531,627,083 碱基对（bp）。
原始测序数据使用 Filtlong 0.2.1 版本，按照默认参数进行初始质量控制，去除质量排名后 5% 的读长。随后，利用 ONT MinION 设备获得的高质量长读长进行从头基因组组装（de novo genome assembly）。使用 Flye 2.9.1 版本进行草图基因组组装，参数设置为 “--nano-raw --genome-size 4 m”，其他参数保持默认。这个组装过程包含一个固有的错误校正步骤。使用 Medaka 1.7.2 版本，利用高质量的 ONT 读长对组装的重叠群进行最终的优化。
经过优化步骤后，解淀粉芽孢杆菌 CIMT3 的最终基因组组装结果显示，基因组总大小为 4,242,144 bp，覆盖度为 98×，由单个环状染色体组成。通过使用 Gepard 进行点图分析，确认了组装的环状结构。使用 Proksee 进行基因组可视化。功能基因的识别和注释使用 NCBI 原核基因组注释管道完成。注释过程预测出总共 4,256 个基因，其中包括 4,042 个蛋白质编码基因和 118 个 RNA 基因。在 RNA 基因中，有 27 个被鉴定为 rRNA 基因，86 个为 tRNA 基因。此外，在基因组中还检测到 96 个假基因。