16S rRNA 基因扩增子测序揭示鲜牛粪与堆肥牛粪细菌群落结构差异及其对农业生态安全的意义

《Microbiology Resource Announcements 0.7》：Bacterial community structure of fresh and composted cattle manure revealed through 16S rRNA gene amplicon sequencing

为探究鲜牛粪与堆肥牛粪细菌群落结构的分类差异，来自马来西亚农业研究与发展研究所（MARDI）的研究人员开展 16S rRNA 基因扩增子测序研究。结果显示，鲜牛粪中厚壁菌门（Firmicutes）占主导，堆肥牛粪中主要是变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidota），该研究对减少微生物污染风险意义重大。

　　研究报告了鲜牛粪和堆肥牛粪的 16S rRNA 基因扩增子测序数据。在门水平的分类分布显示，厚壁菌门（Firmicutes）是鲜牛粪中最主要的菌门，而变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidota）是堆肥牛粪中鉴定出的主要菌门。

牛粪每天大量产生。畜牧生产者通过堆肥处理牛粪，以减少其体积和气味。堆肥方法被广泛用于将牛粪转化为营养丰富的有机肥料，这种高市场价值的堆肥牛粪还可用于改善土壤质量和生产力。然而，确保正确的堆肥操作可以降低微生物污染风险，因为牛粪含有包括病原体在内的多种微生物。为研究鲜牛粪和堆肥牛粪细菌群落结构的分类差异，研究人员进行了 16S rRNA 基因扩增子测序。结果凸显了使用堆肥牛粪、避免直接施用鲜牛粪，以减轻潜在健康和环境风险的重要性。

2023 年 12 月，从马来西亚柔佛州居銮的马来西亚农业研究与发展研究所（MARDI）研究站收集鲜牛粪和堆肥牛粪。使用 DNeasy PowerSoil Pro 试剂盒（德国 QIAGEN 公司）从 250mg 鲜牛粪和堆肥牛粪中提取总 DNA 并混合。通过 1% 三乙酸乙二胺四乙酸（TAE）凝胶电泳观察，并用分光光度计（Implen NanoPhotometer N60/N50）分析 A260/280 和 A260/230 吸光比，以及使用 iQuant Broad Range 双链 DNA 定量试剂盒进行荧光定量，来测定 DNA 的完整性、纯度和浓度。用位点特异性序列引物扩增纯化后的 DNA：16S V3 - V4（正向引物延伸序列：5′ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG‐[CCTACGGGNGGCWGCAG]；反向引物延伸序列：5′ GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG‐[GACTACHVGGGTATCTAATCC]）。所有聚合酶链式反应（PCR）均使用 REDiant 2× PCR Master Mix（1st BASE）进行。文库构建的第一部分是使用位点特异性序列引物扩增选定区域的 16S rRNA 基因，PCR 反应使用 KOD Multi & Epi（日本 Toyobo 公司）进行。文库构建的第二部分是按照制造商的方案，使用 Illumina Nextera XT Index Kit v2 将双索引连接到扩增子 PCR 产物上。使用安捷伦生物分析仪 2100 系统（Agilent DNA 1000 Kit）和 Helixyte Green 定量试剂进行荧光定量来测量文库质量。按照 Illumina 推荐的方案对文库进行标准化和混合，然后使用 MiSeq 平台进行 300bp 双端测序。原始数据使用 DADA2 V1.18 聚类为扩增子序列变体（ASVs），并与 SILVA v132 数据库进行比对。

在门水平的分析显示，厚壁菌门（69.45%）是鲜牛粪中含量最高的菌门，它也是牛肠道中的优势菌门。而堆肥牛粪中的主要分类群是变形菌门（26.88%）和拟杆菌门（13.20%），这些菌群包含参与有机物分解的细菌。

这项工作得到了马来西亚农业和粮食安全部（MAFS）在第十二个马来西亚计划（RMKe - 12）项目资助下的支持。感谢马来西亚农业研究与发展研究所土壤科学、水与肥料研究中心、畜牧科学研究中心以及生物技术与纳米技术研究中心的团队成员在样本采集过程中提供的帮助。所有作者均已阅读并批准该手稿，且声明无利益冲突。