鸡十二指肠局灶性坏死相关大肠杆菌全基因组解析：探寻蛋鸡减产病因的关键突破

《Microbiology Resource Announcements 0.7》：Complete genomes of five Escherichia coli isolated from focal duodenal necrosis lesions of layer chickens

为探究鸡十二指肠局灶性坏死（FDN）病因，研究人员开展研究。从 FDN 病灶分离出 5 株大肠杆菌，测定其全基因组。发现菌株类似禽致病性大肠杆菌（APEC）且携带炎症性肠病（IBD）相关基因，为研究 FDN 病因提供重要依据。

　　鸡十二指肠局灶性坏死（Focal duodenal necrosis，FDN）是蛋鸡中一种易被忽视但影响重大的疾病，会导致产蛋量下降。然而，其病因尚不明确。在此，研究人员报告了从蛋鸡群 FDN 病灶中分离出的 5 株大肠杆菌（E. coli）的完整基因组。这 5 株大肠杆菌是直接从 FDN 病灶样本中，通过在血琼脂和麦康凯琼脂上 37°C 培养 18 - 24 小时分离得到的。可疑菌落通过 16S rRNA PCR 鉴定，并筛选与禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic E. coli，APEC）和炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）相关的基因。研究发现，这些菌株类似 APEC，同时还携带多个 IBD 相关基因。在检测的 5 株 FDN 菌株中，FDN - 4 属于 O25b:H4 ST131 血清群，与 EC958 菌株遗传相似度高，该菌株类型与人类尿路感染有关。O25:H4 ST131 大肠杆菌还常具有氟喹诺酮耐药和超广谱 β - 内酰胺酶（Extended - spectrum β - lactamase，ESBL）耐药特性。所有菌株在麦康凯琼脂上培养前，均保存在 - 80°C 甘油中。挑取单个菌落，在 LB 肉汤中 37°C 培养 24 小时。离心细胞悬液，将细胞沉淀送往 Mr. DNA 进行全基因组测序。每个样本的细菌沉淀重悬于 180μL ATL 缓冲液（Qiagen）中，使用 MagAttract HMW DNA Kit（Qiagen）提取高分子量 DNA。用 Qubit dsDNA HS 检测试剂盒（Life Technologies）评估 DNA 浓度，用 NANODROP 2000（ThermoFisher Scientific）测定样本质量。通过电泳（E - Gel SizeSelect 2% 琼脂糖凝胶；Invitrogen）确定每个基因组 DNA（gDNA）样本的大小，均显示出大于 15 Kb 的荧光条带。样本经 Covaris G - tube（Covaris Inc.）进行片段化处理，并用 Agilent 2100 生物分析仪（Agilent Technologies）验证每个样本的平均大小。取约 1 - 1.5μg gDNA 作为输入，使用 SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0（Pacific Biosciences）进行文库制备。在文库制备过程中，样本经过 DNA 损伤修复、末端修复和条形码接头连接。然后，将文库等摩尔混合，每个混合池包含 5 - 6 个文库。用核酸酶处理去除未连接的 DNA 片段，文库制备完成后，使用 BluePippin 自动大小选择仪器（Sage Science Inc）选择大于 7 Kb 的 DNA 片段。用 Qubit dsDNA HS 检测试剂盒（ThermoFisher Scientific）测量最终文库浓度，用 Agilent 2100 生物分析仪（Agilent Technologies）确定平均文库大小。最终文库使用 PacBio Sequel IIe（Pacific Biosciences）进行测序。HiFi 基因组组装通过 SMRT Link 10.1.0 中的改进相位组装器（Improved phase assembler，IPA）完成。IPA 包括重叠（pancake）、定相（nighthawk）、过滤重叠（falcon）、重叠群构建（falcon）和抛光（racon）步骤。所有组装工具均来自 PacBio，使用软件默认设置。上述 5 株大肠杆菌基因组均使用 NCBI 原核基因组注释管道（Prokaryotic Genome Annotation Pipeline，PGAP）v. 6.9 进行注释。质粒鉴定使用 PlasmidFinder 2.1，采用默认设置。除非另有说明，所有软件均使用默认参数。该研究由鸡蛋产业中心（020999A）和兽医学院院长办公室资助（资助给 C.M.L.）。