碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌共轭质粒的全球传播：威胁与防控关键

这篇研究揭示了携带耐药和毒力基因的共轭质粒（pVir - MDRs）在肺炎克雷伯菌（Kp）中的传播情况。它们分布广泛、类型多样，与菌株序列类型（ST）和血清型相关，对全球健康构成重大威胁，为防控 CR - hvKp 感染提供关键依据。

　　

碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌共轭质粒的研究

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）是引发医院和社区获得性感染的常见病原菌，可导致肺炎、败血症、尿路感染及肝脓肿等多种疾病 。根据疾病特征和遗传特性，Kp菌株主要分为经典型（classical Kp，cKp）和高毒力型（hypervirulent Kp，hvKp）。cKp常携带编码抗微生物耐药性的质粒，在中国，序列类型 11（sequence type 11，ST11）的碳青霉烯耐药Kp（carbapenem - resistant Kp，CR - Kp）最为常见。hvKp则因携带位于毒力质粒或其他可整合到染色体的移动遗传元件上的毒力因子簇而区别于 cKp，潜在生物标志物如peg - 344、iroB、iucA、rmpA和rmpA2以及更高的铁载体产量可用于准确区分这两种致病型。

随着 hvKp不断进化，对碳青霉烯类及其他多种抗生素产生耐药性，碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌（carbapenem - resistant hypervirulent Kp，CR - hvKp）的出现成为重大威胁。研究表明，CR - hvKp的产生是由于碳青霉烯耐药菌株获得 pLVPK 样毒力质粒，或 hvKp菌株携带含各种碳青霉烯酶基因（如bla_{KPC - 2}、bla_VIM、bla_{NDM - 1}）的质粒。尽管有研究支持 hvKp演变为 CR - hvKp的可能性，但Kp毒力质粒通常被认为是非结合性的，关于其转移的研究较少。近期虽有报道称毒力质粒在与辅助质粒或 KPC 质粒融合时可结合转移，且发现了含多重耐药（multidrug resistance，MDR）基因和结合转移基因的大质粒，但对于携带毒力基因、耐药基因和结合转移基因的质粒的分子遗传特征、类型、特性及耐药基因携带情况缺乏系统研究。

材料和方法

1. 细菌菌株和鉴定：Kp菌株 16HN200 于 2016 年从中国河南省某医院患者体内分离得到。使用 Vitek 2 系统（法国生物梅里埃公司）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（德国布鲁克公司）确定菌株种属身份。通过全基因组测序检测该菌株携带的毒力因子（rmpA、rmpA2、iucA和iroN），并按先前描述在血琼脂上进行拉丝试验。所有细菌培养实验，包括结合试验、血清杀伤试验和黏附侵袭试验，均经香港理工大学批准，并遵循临床实验室生物安全指南。
2. 实验动物：选用 6 - 8 周龄的雌雄小鼠，野生型 C57BL/6 小鼠由内部繁殖或从赛业生物购买。所有小鼠均在无特定病原体条件下饲养繁殖，实验使用性别和年龄匹配的对照组。
3. 小鼠菌血症模型：将Kp菌株 SH12019 和 SH12019 - TC 在 LB 肉汤中 37°C 培养 18 小时，然后以 1:100 稀释，继续培养 2.5 小时至对数早期。通过离心收集细菌，用冷磷酸盐缓冲盐水（phosphate - buffered saline，PBS）洗涤两次，再重悬至所需密度。小鼠腹腔注射 1×10⁴菌落形成单位（colony - forming units，CFU）的Kp菌株。
4. 抗生素敏感性测试：根据临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）和 2021 年欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）的指南，采用微量稀释法测定菌株 16HN200 及相关接合子菌株的抗菌药物敏感性。以大肠埃希菌（Escherichia coli）菌株 25922 作为质量控制菌株，测试的抗菌药物包括亚胺培南、厄他培南、美罗培南、头孢噻肟、头孢他啶、阿米卡星、环丙沙星、替加环素、多粘菌素 B 和碲酸盐。所有测试均重复两次，每个菌株每次测试包含三个生物学重复。
5. DNA 测序和生物信息学分析：使用 PureLink 基因组 DNA 迷你试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司）按照制造商说明提取基因组 DNA，然后使用 Illumina HiSeq（美国加利福尼亚州圣地亚哥）和 ONT MinION 平台（英国牛津）进行全基因组测序。利用 Unicycler v0.4.7 对短读长和长读长数据进行从头混合组装。使用 BLAST 环图生成器（BLAST Ring Image Generator，BRIG）v0.95 对结构相似的质粒进行比对。通过基于读取映射的方法，分别使用 ABRicate v1.0.1 和公开的 ResFinder、VFDB 数据库鉴定抗菌耐药基因和毒力因子。使用 MOB - suite v3.1.9 进行可移动性预测。使用 RAST v2.0 和 Prokka v1.14.6 对组装的基因组序列进行注释。使用 Panaroo v1.2.10 生成泛基因组，并使用 RaxML v 8.2.12 基于核心基因组比对构建系统发育树，进行 100 次自展重复。
6. 结合试验：以耐利福平的E. coli菌株 EC600 作为受体，测试毒力质粒是否能够结合转移。将菌株 16HN200 和受体菌株在 LB 培养基中 37°C 培养至光密度 600nm（OD₆₀₀） = 0.6。取 100μL 供体细胞培养物和 400μL 受体细胞培养物混合，小心接种到置于 LB 琼脂平板表面的 0.45μm 滤膜上。37°C 孵育过夜后，收集滤膜上的细菌，用生理盐水重悬并进行系列稀释。将稀释后的培养物涂布在含有 2μg/mL 碲酸钾（K₂TeO₃）和 600μg/mL 利福平的中国蓝琼脂平板上（若以 EC600 为受体）。还以E. coli接合子 EC600 - TC 为供体，经典 CR - Kp菌株为受体进行结合实验，使用含有 8μg/mL 碲酸钾（K₂TeO₃）和 2μg/mL 美罗培南的 MacConkey 琼脂平板筛选接合子。通过 PCR 检测接合子中作为毒力质粒标记基因的rmpA2的存在。
7. 黏液粘度测定、荚膜提取和定量：采用沉降试验测定Kp菌株 SH12019 和 SH12019 - TC 的黏液粘度。将过夜培养物在 LB 培养基中稀释至 OD₆₀₀为 0.2，37°C 培养。6 小时后，将培养物调整至 OD 为 1.0mL^?1，1000×g 离心 5 分钟，去除上清液，在不扰动沉淀的情况下测量 OD₆₀₀。按照先前描述的方法提取和定量糖醛酸。将培养物培养 6 小时后，取 500μL 培养物与 100μL 荚膜提取缓冲液（100mM 柠檬酸，1% 两性离子去污剂 Zwittergent 3 - 12）混合，50°C 孵育 20 分钟，然后离心（5 分钟，13000×g，室温）沉淀细胞碎片。取 300μL 上清液与 1.2mL 无水乙醇混合，沉淀荚膜成分，13000×g 离心 5 分钟。将沉淀风干，重悬于 200μL 无菌水中，加入 1.2mL 四硼酸盐溶液（12.5mM 硫酸四硼酸钠），100°C 孵育 5 分钟，立即在冰上冷却至少 10 分钟。加入 20μL 羟基苯基试剂（0.15% 3 - 苯基苯酚溶于 0.5% NaOH）检测糖醛酸，室温孵育 5 分钟后，测量 520nm 处的吸光度。使用不同浓度的葡萄糖醛酸（美国西格玛奥德里奇公司）溶液构建标准曲线，计算测试样品中的糖醛酸浓度。结果以三个独立实验数据的平均值和标准差表示。
8. 血清杀伤试验：进行血清杀菌试验以测试细菌菌株抵抗血清杀伤的能力。将细菌菌株在 LB 肉汤中 37°C 培养，在对数早期（OD₆₀₀ = 0.3）收集。将细菌悬液调整至浓度为 1×10⁸细菌 /mL 的生理盐水溶液。取 50μL 细菌悬液与 150μL 正常人血清混合，在 96 孔板中 37°C 孵育。在 0、1、2 和 3 小时记录活菌数，每个时间点重复两次。
9. 黏附和侵袭试验：RAW 264.7 细胞在含有 10% 热灭活胎牛血清和 1% 非必需氨基酸的杜氏改良 Eagle 培养基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）中培养。按照先前描述的方法进行Kp的黏附和侵袭试验。在感染Kp前，将细胞在 24 孔板中过夜培养。用 PBS 预洗细胞，将对数中期（OD₆₀₀ = 0.4 - 0.6）的Kp在无 FBS 的 DMEM 中加入各孔，使感染复数（multiplicity of infection，MOI）为 50。通过在 PBS 中系列稀释、涂布在 LB 琼脂上并孵育 12 小时来确定每孔接种的 CFU 数。在黏附试验中，感染板在孵育前以 200×g 离心 5 分钟以促进细菌黏附到细胞上，然后在湿度为 5% CO₂的 37°C 环境中孵育 30 分钟。用 PBS 洗涤孔三次，加入 1mL 0.2% Triton X - 100 破坏细菌与孔的黏附，黏附率为黏附到孔中的接种物比例。在侵袭试验中，将含 10% FBS 的 DMEM 培养基中的Kp加入孔中，孵育 2 小时，用 PBS 洗涤三次，再用含有 300μg/mL 阿米卡星的新鲜培养基孵育 2 小时。最后，通过将破坏后的混合物系列稀释涂布在 LB 琼脂上并在 37°C 孵育 12 小时来确定胞内活菌数，侵袭率为内化的接种物比例。
10. 数据库中共轭毒力质粒比对：以 PLSDB 集合中的质粒（MW911669.1）为参考，使用 BLASTN 进行比对。设定比对长度为 2000bp，覆盖度 80%，同一性 80%，整体质粒覆盖度 60% 作为阈值，从 2023 年 10 月访问的 NCBI 病原体数据库中筛选符合条件的质粒。使用 MOB - suite v 3.1.9 从草图组装中重建质粒，从组装中提取相似质粒并使用 Prokka v1.14.6 进行注释。使用 Panaroo v1.2.10 生成泛基因组，并使用 UMAP 算法进行可视化。
11. 统计分析：使用 GraphPad Prism 6.0 进行数据统计分析。对于正态分布的数据集，采用单因素方差分析（one - way ANOVA）并使用 Tukey 校正进行多重比较。使用对数秩检验比较动物实验中的生存率。P 值 < 0.05 被认为具有统计学意义。除非另有说明，动物实验中小鼠的生存曲线和流式细胞术分析结果均代表至少两个独立实验。

结果

1. 携带 MDR 和毒力基因质粒的特征：研究鉴定出一种来自临床碳青霉烯耐药Kp菌株的 292353bp 的非 pLVPK 样 IncFIB/IncHI1B 质粒（p16HN200 - Vir），它携带多种毒力因子，如黏液表型调节因子 2（rmpA2）、气杆菌素（iucABCD，iutA）以及抗生素耐药基因，如qnrB4、bla_{DHA - 1}、sul1、msr（E）、mph（E）、armA、bla_{SHV - 11}和mph（A）。与 NCBI 数据库比对发现，该质粒与 2017 年中国从痰液中分离的Kp菌株的质粒 p17 - 16 - vir（MK191024.1）相似度最高（覆盖度 90%，同一性 99%）。p16HN200 - Vir 质粒含有来自毒力质粒 pLVPK 的 65kb 插入区域，包括碲抗性簇、rmpA2和iucABCDiutA基因。与典型毒力质粒 pLVPK 相比，这些毒力质粒缺乏毒力基因rmpA和iroBCDN，可能影响 CR - Kp菌株的毒力潜力。同时，p16HN200 - Vir 质粒携带质粒转移tra基因簇。通过结合实验证实，p16HN200 - Vir 携带的tra基因可介导毒力质粒的结合转移。该质粒能与E. coli EC600 结合，且以 EC600 - TC 为供体，与 ST11 Kp菌株 SH12019 和 HvKP4 - PC 结合后，分别产生 SH12019 - TC 和 HvKP4 - PC - TC，结合效率分别为 10^?4和 10^?5。多项生物学试验表明，获得 p16HN200 - Vir 质粒可使Kp菌株表现出更高的毒力。血清抗性实验中，SH12019 - TC 的生存率高于 SH12019；黏附和侵袭实验中，SH12019 - TC 对 RAW 264.7 细胞的黏附和摄取抗性更强；小鼠感染实验中，感染 5×10⁷ CFU SH12019 - TC 的小鼠在 36 小时内死亡率达 100%，而感染 SH12019 的小鼠在 84 小时时生存率约为 70%。
2. pVir - MDR 宿主分布的多样性和复杂性：对 NCBI GenBank 数据库和自有菌株收集物中的完整结合质粒进行综合分析，共收集到 2005 年至 2023 年来自 16 个国家的 94 个完整的 p16HN200 - Vir 样质粒序列，将其重命名为 pVir - MDRs。其中，德国和美国在 2005 年最早鉴定出此类质粒。2019 年，在八个国家收集到 22 株携带 pVir - MDRs 的菌株。从地理分布看，中国、俄罗斯和英国的菌株数量位居前三。这些质粒存在于 19 种 ST 类型的Kp中，最常见的为 ST147、ST11、ST395 和 ST15。不同 ST 类型在地理分布上存在差异，如 ST11 在亚洲最普遍，ST147 在欧洲占主导，俄罗斯以 ST395 为主。从分离来源看，多数菌株来自血液、直肠和尿液。
3. pVir - MDRs 携带的 ARG 的遗传结构和多样性：对 pVir - MDRs 进行泛基因组分析，在 329 个基因中，39 个为核心基因，114 个为软核心基因。毒力基因簇iucABCDiutA高度保守，属于核心基因；质粒转移基因traU和traB为软核心基因，表明 pVir - MDRs 具有高毒力和转移能力。基于 94 个质粒的核心基因构建系统发育树，可将这些质粒分为六个谱系。p16HN200 - Vir 位于谱系 2，与中国 2013 - 2021 年分离的 pVir - MDRs 形成独特的地方谱系。pVir - MDRs 携带八种类型的抗菌耐药基因（antimicrobial resistance gene，ARG），其中 β - 内酰胺酶类基因种类多样，不同谱系携带的 β - 内酰胺酶有所不同。如bla_{DHA - 1}主要存在于中国分离的谱系三质粒中，bla_{OXA - 48}主要由俄罗斯分离的谱系 5 质粒携带，bla_{NDM - 1}和bla_{NDM - 5}分别仅在谱系 6 和谱系 7 中检测到，且