淡水池塘微生物群落中抗生素抗性基因与环境因子的奇妙关联及重大意义

《Microbiology Spectrum 3.7》：Pond water microbiome antibiotic resistance genes vary seasonally with environmental pH and tannins

这篇研究聚焦于俄亥俄州诺克斯县的四个池塘，通过纵向采样分析，发现抗生素抗性基因（ARGs）的流行与 pH、单宁浓度等环境因素相关。该研究有助于了解淡水微生物群落对药物污染的修复能力，为防控抗生素耐药性传播提供依据。

　　

研究背景

池塘作为小型淡水水体，在地球淡水生态系统中占据重要地位，其微生物在生态系统物质循环、能量流动以及温室气体调控等方面发挥着关键作用。然而，由于池塘面积较小，易受农业径流等因素影响，其化学性质复杂多变，成为研究环境变量对微生物群落影响的天然 “实验场”。

近年来，抗生素抗性基因（ARGs）在环境中的传播问题备受关注。水生微生物群落作为潜在的抗生素抗性菌来源，其携带的 ARGs 可能转移至病原菌，对全球公共卫生构成严重威胁。但目前人们对淡水微生物群落修复药物污染的能力以及影响 ARGs 的化学因素知之甚少。特别是多药外排泵这一关键耐药机制，其功能与质子动力（PMF）密切相关，而 pH 作为 PMF 的重要影响因素，在池塘环境中变化多样。此外，池塘中的植物多酚如单宁酸可酸化水体，藻类和蓝细菌的光合作用又会改变 pH，这些因素如何影响 ARGs 的流行尚不明晰。

本研究旨在探究农业景观中池塘微生物分类群和 ARGs 的流行变化规律，以及 pH 和其他化学因素在其中所起的作用，为深入理解淡水生态系统中 ARGs 的传播机制提供科学依据。

材料与方法

1. 实验材料：研究选取了俄亥俄州诺克斯县的四个池塘，分别为 Burtnett pond、Ariel - Foundation Park Lake 2（Foundation pond）、McManis pond 和 Porter pond。这些池塘周边环境各异，Burtnett pond 是经修复的湿地，周边有大豆田和牧羊场；Foundation pond 由废弃的石英砂采石场改造而成；McManis pond 有家禽和山羊的粪便输入；Porter pond 周边有大量橡树、枫树和松树。
2. 实验方法：在 2021 年和 2022 年的特定时间段内，每周对四个池塘进行水样采集。采集的水样在现场测定 pH、电导率、温度和溶解氧浓度等指标，之后在实验室进行过滤收集微生物样本，并对滤液进行多种化学指标分析，如正磷酸盐、氨、硝酸盐、单宁浓度等，2022 年还测定了溶解性有机碳（DOC）。

对采集的微生物样本进行 DNA 提取，利用 ZymoBIOMICS DNA mini - prep kit 提取元基因组 DNA，并以 Mock community 作为对照。提取的 DNA 经纯度检测后，由 Admera Health 公司构建文库，采用 Illumina NovaSeq S4 平台进行测序，测序读长为 150 PE，每个样本产生 40 M PE reads（双向各 20 M）。

运用 ShortBRED - Identify 程序，将元基因组短读序列与基于综合抗生素抗性数据库（CARD 3.1.2）生成的 ARGs 标记进行匹配，过滤掉与 UniRef90 数据库相似的序列，确定真正的标记（True Markers）、连接标记（Junction Markers）和准标记（Quasi Marker）。通过 ShortBRED - Quantify 程序对每个样本的修剪后的 FASTQ 文件进行分析，当序列与标记的比对同一性达到 95% 及以上，且比对长度至少为标记全长或包含 95% 的读长时，记为一次 “命中”，以此计算每个 ARGs 的相对丰度。

利用 Trimmomatic 软件对 DNA 序列 FASTQ 文件进行修剪，去除接头和低质量序列。使用 Kraken2 程序基于 RefSeq 参考数据库对样本中的序列进行分类鉴定，通过比对 k - mers 确定最低共同祖先（LCA），并报告各分类群的相对丰度。再利用 Bracken v2.9 程序，基于 Kraken2 的结果，通过贝叶斯概率重新估算属水平的相对丰度，排除 “human” 序列结果以提高准确性。

采用 R 统计软件（v4.1.2）进行非参数统计分析。运用 Spearman 相关性分析探究各变量之间的关系，通过线性回归分析单宁浓度和 pH 的关系，并绘制热图展示相关性结果。利用非度量多维缩放（NMDS）技术，分析环境因素与优势属之间的关联。

实验结果

1. 池塘的物理特征和化学性质：四个池塘的水化学性质差异显著，pH、单宁浓度和磷酸盐水平各不相同。Burtnett pond 的 pH 最低，单宁浓度、溶解磷酸盐和溶解性有机碳（DOC）含量最高；Foundation pond 的电导率较高，表明其盐度相对较高；McManis pond 和 Porter pond 的各项指标则呈现出不同程度的变化。

pH 与单宁浓度之间存在显著的负相关关系，Spearman 相关系数在 2021 年为 - 0.46（P < 0.001），2022 年为 - 0.73（P < 0.001）。季节变化对池塘的酸度和单宁水平也有影响，Burtnett pond 的 pH 在 2021 年波动较大，2022 年 9 - 11 月低于 7；Foundation pond 的 pH 始终高于 7，且在 2022 年秋季高于其他池塘。Burtnett pond 的单宁含量在秋季达到最高，其他池塘在秋季也有所增加，但仍低于 Burtnett pond。此外，池塘水温从夏季到秋季逐渐下降。2. 池塘中 ARGs 相对丰度的独特模式：通过 ShortBRED 程序检测，在两个年份中，最常见的三种 ARGs 分别为 smeB、mtrA 和 OXA - 156。smeB 基因编码嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）的 SmeABC 多药外排泵亚基，mtrA 基因是分枝杆菌（Mycobacterium）等菌中的全局响应调节因子，可介导耐药性和酸应激反应，OXA - 156 编码一种 β - 内酰胺酶。

不同池塘中其他 ARGs 的排名存在差异，如 β - 内酰胺酶 OXA - 409 在 Burtnett pond 中高度流行，而在其他池塘中则很少出现；大环内酯糖基转移酶基因 oleD 在 2021 年的 McManis pond 中流行，但 2022 年未检测到。3. 特定 ARGs 的相对丰度与酸度和单宁浓度的相关性：对 2021 年和 2022 年排名前 30 的 ARGs 进行分析，发现其中 20 个 ARGs 在两年中均出现。在 2021 年，10 个 ARGs（smeB、mtrA、OXA - 409、otrC、Erm (O) - lrm、CTX - M - 25、floR、OXA - 372、adeH 和 BUT - 1）与酸度和单宁浓度呈正相关；在 2022 年，smeB、mtrA、OXA - 409、CTX - M - 25 和 OXA - 372 也呈现出相同的正相关趋势。

以 Burtnett pond 为例，2022 年秋季 pH 值普遍低于 7，单宁浓度较高，此时 smeB、mtrA 以及前 30 个 ARGs 的水平均有所增加。smeB 和 mtrA 的计数与 pH 呈弱负相关（smeB：R = - 0.18，P = 0.27；mtrA：R = - 0.39，P = 0.02），与单宁浓度呈强正相关（smeB：R = 0.55，P < 0.001；mtrA：R = 0.33，P = 0.04）。此外，DOC 水平总体与 pH 呈显著负相关（R = - 0.64，P < 0.001），但在 Burtnett pond 中无显著相关性（R = - 0.13，P = 0.74），仅 OXA - 409 和 OXA - 46 与 DOC 呈正相关。水温和磷酸盐与 ARGs 相对丰度的相关性较弱。4. 池塘中微生物分类群的独特模式及时间变化：通过 Kraken2/Bracken 管道分析，发现 60% 的前 30 个 ARGs 存在于 γ - 变形菌纲（Gammaproteobacteria）物种中。在 2021 年和 2022 年的元基因组中，放线菌门（Actinobacteria）和 β - 变形菌纲（Betaproteobacteria）在所有池塘和季节中相对丰度较高。其中，主要的放线菌属为 Planktophila 和 Nanopelagicus，主要的 β - 变形菌属为 Polynucleobacter、Limnohabitans 和 Methylopumilus。

Foundation pond 的微生物分类群模式与其他三个池塘不同，秋季（9 - 11 月）蓝细菌（Cyanobacteria）高度丰富，且 2021 年夏季至秋季蓝细菌的属从聚球藻属（Synechococcus）转变为浮游颤藻属（Planktothrix）。5. pH 和单宁驱动微生物群落结构：利用非度量多维缩放（NMDS）分析发现，某些微生物分类群根据 pH / 单宁轴聚类。蓝细菌如 Cyanobium、Synechococcus 和 Microcystis 通常与弱碱性 pH 和较低的单宁浓度相关，这些条件在 Foundation pond 秋季最为典型，且此时 ARGs 计数较低。

许多放线菌（如 Streptomyces、Mycobacterium 和 Aurantimicrobium）以及 β - 变形菌（Polynucleobacter 和 Limnohabitans）在酸性、高单宁条件下更为普遍，单宁与 Aurantimicrobium 和 Polynucleobacter 的相对丰度高度相关。此外，蓝细菌（Planktothrix、Anabaena、Synechococcus 和 Cyanobium）还与较高的电导率水平聚类，其中 Planktothrix 的相对丰度与 pH 呈显著负相关（Spearman R = - 0.76，P < 0.01），与磷酸盐水平无明显关联（R = - 0.05，P = 0.74）。

讨论

目前，关于池塘和湖泊中季节性 ARGs 流行的驱动因素尚不明确。已有研究对不同水体中 ARGs 的流行情况进行了探讨，但未形成统一的模型。本研究中的四个池塘地理位置相近，地质条件相似且靠近农业区，但其化学和物理因素存在差异，为研究提供了天然的实验条件。

Burtnett pond 的单宁酸和磷酸盐含量较高，Foundation pond 的 pH 值较高且电导率较高。池塘中的 ARGs 在秋季（2022 年 11 月左右）达到最高计数，此时水体酸化程度最大。smeB 和 mtrA 基因的高表达与低 pH 环境相关，这与它们在酸应激反应和耐药机制中的作用一致。

池塘中 ARGs 的季节性变化可能与池塘的酸度和单宁含量有关。秋季树木落叶，导致 Burtnett pond 和 Porter pond 的单宁含量增加，pH 值下降。此外，池塘微生物群落中的 ARGs 来源于多种环境微生物，部分微生物如嗜麦芽窄食单胞菌和非结核分枝杆菌，虽对大多数人无害，但对免疫功能低下的患者可能构成威胁。

淡水水体中 ARGs 的流行受多种因素影响，其中人类和农业来源的耐药菌输入是重要因素之一。同时，环境群落具有一定的抗耐药菌入侵能力。本研究表明，某些 ARGs 的丰度可能受水 pH 值影响，酸化和单宁输入可能起到促进作用。后续可通过微宇宙控制实验进一步评估 pH 值的影响程度，并探究其是否通过能量代谢机制起作用，这对于深入了解耐药菌在环境中的传播和控制具有重要意义。