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本文聚焦香蕉枯萎病菌（Foc），鉴定出新型效应蛋白 FoSSP71。它能抑制植物免疫反应，影响病菌生长和致病力。研究为香蕉枯萎病防控、抗病品种培育提供理论依据，在农业领域意义重大。
### 香蕉枯萎病的严峻挑战与研究背景
香蕉作为全球重要水果，既是热带和亚热带国家的主食，也是重要经济作物。然而，香蕉生产深受多种病害威胁，其中香蕉枯萎病由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，Foc）引起，是极具破坏性的病害。Foc 是土壤传播的真菌病原体，遗传多样性显著，依据对不同香蕉品种的致病性可分为多个生理小种，热带 4 号小种（Tropical Race 4）对广泛种植的卡文迪许（Cavendish）香蕉品种危害极大，一旦入侵香蕉种植园，会迅速传播，致使产量锐减，给全球香蕉产业造成巨额经济损失，严重影响相关地区的社会经济稳定。
在病原体与植物的相互作用中，病原体进化出多种策略来抑制或逃避宿主的免疫反应。在感染的不同阶段，病原体会编码众多促进真菌定植的蛋白质，其中效应蛋白发挥着关键作用。效应蛋白能显著影响植物的防御反应，损害植物健康和生长。尖孢镰刀菌（F. oxysporum）基因组编码超 1300 种分泌蛋白，可改变植物细胞结构和代谢途径，例如已被深入研究的分泌在木质部（SIX）蛋白家族，以及其他类型的效应蛋白如 FocM35_1、Fosp9 等，它们都在真菌致病性中扮演重要角色。此前研究已鉴定出 Foc4 中的 80 个候选效应蛋白，为深入研究 Foc4 效应蛋白奠定了基础。
FoSSP71 的发现与特性
研究人员发现并鉴定了一个来自 Foc 的新型效应蛋白 FoSSP71，其编码基因（FOIG_04289，Gene ID：42029464）可编码含 239 个氨基酸的蛋白质，该蛋白 N 端有信号肽（SP），但无跨膜结构域，属于经典分泌蛋白。通过对美国国家生物技术信息中心（NCBI）非冗余蛋白质数据库的分析，发现 FoSSP71 在多种镰刀菌属（Fusarium）物种中存在同源蛋白，在其他高等子囊菌中也有同源物，序列相似性在 70% - 99% 之间，表明其在进化上具有高度保守性。
利用酵母分泌系统试验对 FoSSP71 的分泌功能进行验证，构建含 pSUC2 - FoSSP71sp的载体并转化至酵母菌株 YTK12，以 Avr1b 为阳性对照，未转化的 YTK12 和含 pSUC2 的 YTK12 为阴性对照。结果显示，FoSSP71sp能使酵母在 YPRAA 培养基上生长，并将 2,3,5 - 三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液还原为红色，证明其 N 端 SP 具有分泌活性。借助农杆菌介导的瞬时表达系统研究 SP 对 FoSSP71 亚细胞定位的影响，将 FoSSP71 - GFP 和 FoSSP71ΔSP - GFP 融合蛋白在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中表达，以空 GFP 载体为对照。激光共聚焦显微镜观察发现，FoSSP71 - GFP 定位于细胞间隙，而 FoSSP71ΔSP - GFP 在细胞膜和细胞核中均有分布，表明 SP 对 FoSSP71 的亚细胞定位起关键作用。
FoSSP71 对植物免疫反应的影响
为探究 FoSSP71 对植物免疫反应的作用，将其在本氏烟草中瞬时表达，并构建 FoSSP71 及其 SP 缺失突变体（FoSSP71ΔSP）至植物瞬时表达载体 PVX，利用农杆菌介导转化系统将携带构建体的农杆菌注入本氏烟草叶片进行瞬时表达。24 小时后，在相同位点注射 PVX 融合蛋白。Bcl - 2 家族成员 BAX 可调节细胞凋亡，能强烈诱导本氏烟草细胞死亡。实验结果显示，浸润 3 天后，FoSSP71 和 FoSSP71ΔSP均有效抑制 BAX 介导的本氏烟草叶片细胞死亡，蛋白质免疫印迹（Western blot）分析证实了 FoSSP71 和 FoSSP71ΔSP融合蛋白在本氏烟草中的表达。
鉴于 FoSSP71 能抑制 BAX 诱导的细胞程序性死亡（PCD），研究人员推测其可能抑制植物免疫早期的关键防御机制，如活性氧（ROS）爆发和胼胝质积累。将 FoSSP71 - GFP 融合蛋白在本氏烟草叶片中瞬时表达，2 天后用鞭毛蛋白（flg22）处理叶片诱导 ROS 产生。12 小时后，利用 3,3′ - 二氨基联苯胺（DAB）染色观察 ROS 爆发，结果显示，与对照组相比，表达 FoSSP71 的叶片 ROS 产生显著减少。同时，苯胺蓝染色结果表明，FoSSP71 表达也显著降低了胼胝质沉积。进一步分析植物免疫信号通路相关标记基因的表达水平，包括水杨酸（SA）信号通路相关的 NbPR1 和 NbPR5、茉莉酸途径相关的 NbPR3 和 NbLOX 以及乙烯途径相关的 NbERF1。在将 FoSSP71 注入本氏烟草 24 小时后，发现表达 FoSSP71 的本氏烟草中 NbPR1 和 NbPR5 的表达显著降低，NbLOX 表达略有增加，而 NbPR3 和 NbERF1 的表达水平与对照植物相比无显著变化，表明 FoSSP71 可能通过下调 SA 信号通路相关基因的表达来调节植物免疫。
FoSSP71 缺失对 F. oxysporum 的影响
为研究 FoSSP71 对 Foc 致病性的影响，运用 split - marker 法和原生质体转化技术构建 FoSSP71 缺失突变体。成功在 Foc4 中开发出携带潮霉素抗性标记的 FoSSP71 突变体，并通过聚合酶链式反应（PCR）进行验证。将 FoSSP71 编码区克隆至 pFL2 载体，经聚乙二醇（PEG）介导的原生质体转化导入 ΔFoSSP71 菌株，构建遗传互补菌株（FoSSP17 - C），并通过 PCR 验证。对野生型（WT）、ΔFoSSP71 和 FoSSP17 - C 菌株进行菌落形态鉴定，在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上培养 6 天后，ΔFoSSP71 的色素沉着明显减少，菌落直径比 WT 和 FoSSP17 - C 减小约 28%。在马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）培养基中培养 3 天后，分析 ΔFoSSP71 菌株的分生孢子产量，发现其比 WT 和 FoSSP17 - C 减少约 45%，表明 FoSSP71 对真菌生长和发育至关重要。
用 WT、ΔFoSSP71 和 FoSSP71 - C 菌株的分生孢子悬浮液接种香蕉根，评估 FoSSP71 在 Foc4 致病力中的作用。接种 30 天后，感染 FoSSP71 缺失突变体的香蕉植株病状明显减轻，黄叶数量减少，假茎黑褐色变色程度降低，病情指数显著低于接种 WT 和 FoSSP71 - C 的植株。定量实时聚合酶链式反应（qRT - PCR）分析显示，与感染 WT 菌株的香蕉相比，感染 ΔFoSSP71 菌株的香蕉中病程相关（PR）基因表达显著上调，有力证明 FoSSP71 是 Foc4 的关键致病因子，可促进病害发展并抑制宿主防御反应。
研究结论与展望
本研究通过分子生物学、生物信息学和功能验证实验，深入揭示了 FoSSP71 作为 Foc4 关键致病因子的重要作用。FoSSP71 在进化上高度保守，其 SP 决定亚细胞定位，并能抑制植物免疫反应，包括 ROS 爆发、胼胝质沉积和防御相关基因表达。敲除 FoSSP71 显著降低 Foc4 对香蕉的致病性，对真菌发育产生负面影响，导致菌落直径减小 28%，分生孢子产量减少 45%。
该研究为香蕉枯萎病的防控提供了潜在靶点，为开发抗枯萎病香蕉品种和有效病害控制策略奠定了科学基础。未来可基于这些发现，研发针对 FoSSP71 的抑制剂，培育抗病香蕉品种，建立综合病害管理系统，在农业生产中具有广阔的应用前景。
