绝经女性接种狂犬病疫苗的免疫反应研究：雌激素缺乏的影响及意义

《Microbiology Spectrum 3.7》：When estrogen deficiency meets immune responses induced by rabies vaccination

这篇研究通过构建双侧卵巢切除（OVX）小鼠模型，探究雌激素缺乏对绝经女性狂犬病疫苗免疫反应的影响。结果表明，雌激素缺乏虽使免疫反应稍弱，但仍能有效防护。该研究为绝经女性接种狂犬病疫苗提供理论依据。

　　### 研究背景
在生命科学和健康医学领域，疫苗临床研究通常聚焦 18 - 65 岁健康人群，绝经女性等特殊群体常被排除在外。绝经是女性生命中的重要阶段，随着全球人均寿命增长，绝经后阶段约占女性生命周期的三分之一。绝经后女性由于雌激素缺乏，呈现慢性低度炎症表型，体内细胞因子表达和免疫细胞发生改变，如炎症细胞因子白细胞介素 1β（IL - 1β）、IL - 6 和肿瘤坏死因子 α（TNF - α）水平升高，免疫细胞数量也有所变化，这使得她们更易感染疾病。

狂犬病是一种由狂犬病病毒（RABV）引起的病毒性疾病，在全球 150 多个国家和地区流行，每年造成大量的伤残调整生命年损失和经济损失，亚洲地区每年约 3.5 万人死于犬介导的狂犬病，约占全球死亡人数的 60%（约 5.9 万人）。一旦出现临床症状，狂犬病几乎无法治愈，及时接种疫苗是预防狂犬病的有效策略。然而，目前尚不清楚绝经后女性因雌激素缺乏导致的免疫功能变化是否会影响狂犬病疫苗的有效性，因此本研究构建 OVX 小鼠模型，模拟绝经后女性雌激素缺乏状态，探究其接种狂犬病疫苗后的体液免疫和细胞免疫反应，为绝经女性狂犬病预防和治疗提供理论基础。

材料和方法

1. 细胞和病毒株：实验使用的 BHK - 21 细胞（幼年地鼠肾成纤维细胞）、LBNSE 病毒株保存于实验室，Neuro - 2a 细胞（小鼠神经母细胞瘤细胞）购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。这些细胞在添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素 / 链霉素的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中，于 37°C、5% CO₂条件下培养。
2. 动物伦理声明：选用 8 - 10 周龄雌性 BALB/c 小鼠，购自济南兴康生物技术有限公司，饲养于无特定病原体（SPF）环境。实验中动物麻醉和安乐死遵循 ARRIVE 报告指南原则，采用 CO₂对小鼠实施安乐死，随后采集样本。
3. 卵巢切除（OVX）小鼠模型的建立：将 8 - 10 周龄雌性 BALB/c 小鼠随机分为 OVX 组和假手术（Sham）组。小鼠经腹腔注射 1.25% 三溴乙醇溶液（每 10g 小鼠体重注射 0.2mL）麻醉后，OVX 组进行双侧卵巢切除术，Sham 组则切除卵巢周围相同大小的脂肪组织。术后两周，每组取 4 只小鼠采集血样，通过 17β - 雌二醇酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清雌二醇浓度。
4. 免疫和致病性实验：将 8 - 10 周龄雌性 BALB/c 小鼠随机分为三组（每组每个时间点 n = 8）：对照组（Mock）、LBNSE - Sham 组和 LBNSE - OVX 组。分别给相应组小鼠肌肉注射 100μL 病毒混合物（相当于 1×10^8.5半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）的 rLBNSE 病毒）或 DMEM。免疫后 21 天内记录小鼠体重和健康状况，评估 LBNSE 的致病性。免疫四周后，用 100 倍致死剂量（MLD₅₀）的街毒 RABV HuNPB3 株对小鼠进行攻毒，观察并记录攻毒后 21 天内小鼠的饮食状况、临床症状和存活率。
5. 病毒中和抗体（VNA）测定：在免疫后 2 周、4 周和 8 周，分别采集 Mock 组、LBNSE - Sham 组和 LBNSE - OVX 组 BALB/c 小鼠的血样（每组每个时间点 n = 8），采用荧光抗体病毒中和试验（FVAN）检测抗 RABV 病毒中和抗体（VNAs）水平。
6. 流式细胞术：在免疫后第 3 天、第 6 天和第 9 天，采集 Mock 组、LBNSE - Sham 组和 LBNSE - OVX 组 BALB/c 小鼠（每组每个时间点 n = 5）的腹股沟淋巴结（LNs）或外周血，制备单细胞悬液，分别用针对淋巴结中树突状细胞（DCs，标记物为 CD80⁺、MHC I⁺、MHC II⁺、CD86⁺和 CD11c⁺）或淋巴结及外周血中 B 细胞（标记物为 CD40⁺和 CD19⁺）的抗体进行染色。使用流式细胞仪（BD FACS Celesta）检测并收集信号，用 FlowJo V10 软件分析数据。
7. 酶联免疫斑点试验（ELISpot）：免疫 4 周后，采集 Mock 组、LBNSE - Sham 组和 LBNSE - OVX 组 BALB/c 小鼠（每组 n = 5）的脾脏，经 CO₂安乐死后，分离脾淋巴细胞，在 37°C、5% CO₂条件下，用 2μg 灭活纯化的 RABV 病毒颗粒刺激 16 - 24 小时。使用小鼠 IL - 4/IFN - γ ELISpot 试剂盒，按照说明书操作，测定分泌 IL - 4 或 IFN - γ 的淋巴细胞数量，通过 ELISpot 酶标仪（AID ELISpot reader - iSpot）消除背景反应后计算斑点形成细胞（SFCs）数量。
8. 细胞内细胞因子染色（ICS）：免疫 4 周后，用 CO₂安乐死 Mock 组、LBNSE - Sham 组和 LBNSE - OVX 组免疫小鼠（每组每个时间点 n = 4），收集脾脏，用 70μm 细胞筛研磨，经 2× 红细胞裂解缓冲液裂解后获得单细胞悬液。将细胞置于六孔板中，每孔加入 2×10⁶个细胞，在含 10% FBS 的 1640 培养基中培养。用 RABV G 蛋白（10μg/mL）和蛋白转运抑制剂在 37°C 刺激 8 小时后，收集细胞，加入抗小鼠 CD16/CD32 抗体孵育 15 分钟，然后分别用抗 CD4 和抗 CD8 单克隆抗体染色，透化处理后再用抗 IFN - γ 和抗 IL - 4 单克隆抗体在 4°C 染色 30 分钟。使用 BD FACS Celesta 流式细胞仪和 FlowJo V10 软件检测和分析染色结果。
9. 酶联免疫吸附测定（ELISA）：在免疫后 2 周、4 周和 8 周，采用 ELISA 法检测 Mock 组、LBNSE - Sham 组和 LBNSE - OVX 组小鼠血清中抗 RABV 的 IgG1 和 IgG2a 抗体水平（每组每个时间点 n = 5）。在 96 孔板中预先包被 1μg 纯化的 RABV G 蛋白，确保能检测到免疫小鼠血清中针对 RABV 的 IgG1 和 IgG2a 水平。洗涤和封闭后，加入 100μL 经 10 倍系列稀释的 LBNSE - Sham 组和 LBNSE - OVX 组小鼠血清，4°C 孵育过夜。洗涤后，加入 100μL 稀释度为 1:500 的辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠 IgG1 和 IgG2a 抗体，室温孵育 3 小时。洗涤后加入 ABTS 显色液，37°C 孵育 15 分钟，用酶标仪（Mutishan MK3，Thermo Scientific）测定 405nm 处的吸光度。以 Mock 组未感染 RABV 的血清样本调整临界值，当样本吸光度（OD）值≥2.1 倍临界值时判定为阳性。
10. 统计分析：实验重复进行，数据至少收集三次。使用 SPSS 26.0 统计软件进行数据分析，结果以均值 ± 标准差表示。用 GraphPad Prism 8 统计软件绘制图表，通过单因素方差分析（ANOVA）和 t 检验确定组间差异，P < 0.05 认为差异具有统计学意义。

实验结果

1. LBNSE 病毒在 OVX 小鼠中的致病性和免疫原性：手术 2 周后检测血清雌激素水平和子宫重量，结果显示 OVX 组血清雌激素水平和子宫重量显著低于 Sham 组，表明成功构建雌激素缺乏小鼠模型。免疫后 21 天内观察发现，Mock 组、LBNSE - Sham 组和 LBNSE - OVX 组小鼠身体活动和饮食状况正常，无狂犬病症状，LBNSE - OVX 组小鼠体重变化趋势与其他两组相似，无显著差异，说明 OVX 和 LBNSE 免疫对小鼠无明显病理影响。LBNSE - Sham 组小鼠在免疫后 2 周、4 周和 8 周的平均 VNA 浓度分别为 3IU/mL、4.93IU/mL 和 1.29IU/mL，LBNSE - OVX 组分别为 3.37IU/mL、2.01IU/mL 和 1.126IU/mL，两组在三个时间点的 VNA 浓度均高于世界卫生组织（WHO）推荐的 RABV 最小保护值 0.5IU/mL。虽然 LBNSE - OVX 组在 4 周时抗体数量略低于 LBNSE - Sham 组，但差异无统计学意义；2 周时两组 VNA 浓度相似，但 LBNSE - OVX 组在免疫 4 周后 VNA 水平下降，且下降速率大于 LBNSE - Sham 组。LBNSE 免疫 4 周后进行攻毒实验，结果显示 LBNSE - Sham 组和 LBNSE - OVX 组小鼠在 RABV HuNPB3 株致死性攻毒后观察期内全部存活，且无狂犬病临床症状，而 Mock 组小鼠出现典型狂犬病症状并在 21 天内全部死亡，表明 OVX 后 LBNSE 免疫能像正常免疫一样完全保护小鼠免受致死性 RABV 攻击。
2. OVX 改变小鼠 DCs 和 B 细胞的募集与激活：免疫后第 3 天、第 6 天和第 9 天，对 Mock 组、LBNSE - Sham 组和 LBNSE - OVX 组小鼠的腹股沟淋巴结和外周血进行 DCs 和 B 细胞流式细胞术检测。结果显示，在免疫后第 6 天，LBNSE - Sham 组 CD11c⁺CD80⁺ DCs 百分比高于 Mock 组，第 9 天高于 LBNSE - OVX 组；第 9 天，LBNSE - OVX 组 CD11c⁺CD86⁺ DCs 百分比显著低于 LBNSE - Sham 组；第 6 天，LBNSE - OVX 组 CD11c⁺MHC - II⁺ DCs 数量显著少于 LBNSE - Sham 组，表明雌激素缺乏部分抑制了 DCs 的募集 / 激活。对于 B 细胞，在免疫后第 9 天，LBNSE - OVX 组淋巴结中 CD19⁺CD40⁺ B 细胞百分比低于 LBNSE - Sham 组，而在第 6 天，其外周血中 CD19⁺CD40⁺ B 细胞百分比高于 LBNSE - Sham 组，说明雌激素缺乏对淋巴结和血液中 CD19⁺CD40⁺ B 细胞的产生可能有相反影响。
3. 雌激素缺乏未抑制小鼠特异性 T 细胞反应：免疫 4 周后，通过 ELISpot 检测 Mock 组、LBNSE - Sham 组和 LBNSE - OVX 组小鼠脾脏中分泌 IL - 4 或 IFN - γ 的 T 细胞数量。结果显示，LBNSE - Sham 组产生 IL - 4 的 T 细胞数量显著多于 Mock 组，LBNSE - Sham 组和 LBNSE - OVX 组产生 IFN - γ 的 T 细胞数量均显著多于 Mock 组，但 LBNSE - Sham 组和 LBNSE - OVX 组之间无显著差异。进一步通过 ICS 分析免疫 4 周后小鼠脾脏中特异性 T 细胞激活情况，结果显示，LBNSE - Sham 组和 LBNSE - OVX 组中 CD4⁺IFN - γ⁺ T 细胞、CD4⁺IL - 4⁺ T 细胞和 CD8⁺IL - 4⁺ T 细胞百分比均显著高于 Mock 组，且两组之间无显著差异。这表明 LBNSE 免疫促进了 LBNSE - Sham 组和 LBNSE - OVX 组小鼠脾脏中 CD8⁺ T 细胞、CD4⁺ Th1 和 Th2 细胞的生成，雌激素缺乏未显著抑制 LBNSE 免疫小鼠的特异性 T 细胞激活。
4. 雌激素缺乏诱导 LBNSE 免疫小鼠产生特异性抗体亚型：通过 ELISA 检测免疫后 2 周、4 周和 8 周小鼠血清中 RABV 特异性 IgG1 和 IgG2a 抗体亚型。结果显示，LBNSE - Sham 组和 LBNSE - OVX 组小鼠在各时间点的 IgG1 和 IgG2a 水平均无显著差异，表明 OVX 小鼠在 LBNSE 免疫后 RABV 特异性 IgG1 和 IgG2a 的产生无明显变化。但通过比较不同时间点的 IgG1 和 IgG2a 滴度发现，LBNSE - Sham 组小鼠表现出更平衡的 Th1 和 Th2 型免疫反应，而 LBNSE - OVX 小鼠在免疫后期倾向于 Th2 主导的体液免疫反应。

讨论

绝经女性的免疫变化除了与年龄相关，还与雌激素缺乏密切相关。本研究通过建立 OVX 小鼠模型，发现雌激素缺乏虽略微削弱了狂犬病免疫反应，但在观察期内仍能提供足够的有效保护。LBNSE - OVX 小鼠的 VNA 滴度下降速度比 LBNSE - Sham 小鼠快，且淋巴结和外周血中 DCs 和 B 细胞的募集 / 激活以及 Th 细胞偏向的免疫反应发生改变，因此可能需要采取其他措施来延长和增强绝经女性接种狂犬病疫苗后的保护效果。

已有研究表明，绝经后女性体内促炎细胞因子水平升高，免疫细胞功能下降，导致对病原体的免疫反应减弱，更易感染疾病。例如，绝经会增加 COVID - 19 的严重程度、有创机械通气需求和疾病死亡率，而接受激素替代疗法（HRT）的绝经后女性患严重 COVID - 19 的风险降低。在疫苗免疫方面，雌激素缺乏可能会削弱疫苗诱导的免疫反应。如成年和老年雌性恒河猴卵巢切除后，接种改良痘苗病毒安卡拉株（MVA）疫苗后 T 细胞细胞因子和 IgG 产生减少；单纯接种 2 型单纯疱疹病毒疫苗对卵巢切除小鼠生殖器疱疹感染的预防效果不如正常对照小鼠，补充雌二醇可显著减轻疾病严重程度；与完整雌性小鼠相比，性腺切除的雌性小鼠接种灭活 A/Cal/09 H1N1 疫苗后 IgG 和中和抗体滴度较低，补充外源性雌二醇可弥补这一不足。然而，由于先前研究在动物模型、免疫时间、病毒类型和疫苗使用等方面存在差异，难以得出普遍适用的免疫理论，雌激素缺乏对狂犬病疫苗接种的精确影响仍需进一步研究。

狂犬病疫苗的效果依赖于快速产生的抗体介导的中和作用，本研究中 LNBSE - OVX 小鼠的 VNA 滴度虽略低于 LBNSE - Sham 小鼠，但在免疫后 2 周、4 周和 8 周均高于 0.5IU/mL，足以在观察期内保护小鼠免受狂犬病侵害。不过，LBNSE - OVX 小鼠 VNA 水平的衰减速度更快，提示可能需要更多措施来维持足够的 VNA 产生以抵御狂犬病攻击。

DCs 作为强大的抗原呈递细胞，在固有免疫和适应性免疫之间起关键连接作用。本研究发现，LBNSE - OVX 小鼠淋巴结中 CD11c⁺CD86⁺ DCs 和 CD11c⁺MHC - II⁺ DCs 的百分比低于 LBNSE - Sham 小鼠，表明雌激素缺乏可能部分损害 DCs 的抗原呈递能力。先前研究表明，雌激素（E2）可增加 DCs 表面 MHC II、CD40 和 CD86 的表达，但在无外源抗原刺激时，完整小鼠、OVX 小鼠和补充 E2 的 OVX 小鼠脾脏中 DC 群体的激活标记物表达无差异。进一步研究发现，E2 通过细胞内雌激素受体 α（ER - α）调节 cDC 群体中 MHC - II 的表达，这有助于解释 OVX 小鼠接种 LBNSE 后，与完整小鼠相比，CD11c⁺CD86⁺和 CD11c⁺MHC - II⁺ DCs 比例下降的现象。

雌激素受体 ER - α 和 ER - β 在小鼠 B 细胞中表达，E2 可对 B 细胞产生直接分子作用，并转录调节细胞活性和功能。高雌激素水平与女性 B 细胞介导的免疫改善和抗病毒感染能力增强相关。接种疫苗后，活化的 B 细胞在次级淋巴组织中快速增殖和分化。本研究中，LBNSE - OVX 组在免疫后第 6 天外周血中 CD19⁺CD40⁺ B 细胞百分比高于 LBNSE -<