合成宿主防御肽对抗痤疮丙酸杆菌：预防和治疗假体关节感染的新希望

《Microbiology Spectrum 3.7》：D-enantiomeric antibiofilm peptides effective against anaerobic Cutibacterium acnes biofilm

这篇研究聚焦于合成宿主防御肽（HDPs）对痤疮丙酸杆菌（C. acnes）的作用。研究发现，部分合成 HDPs 对该菌的浮游生长、生物膜形成及内化均有抑制效果，有望成为预防或治疗C. acnes假体关节感染（PJI）的新策略。

　　

研究背景

随着骨科植入手术的增加，假体关节感染（PJI）成为重大公共卫生挑战。痤疮丙酸杆菌（Cutibacterium acnes）是导致 PJI 的重要病原体之一，约占 PJI 病例的 10%。C. acnes是一种厌氧革兰氏阳性菌，其感染诊断困难，且易形成生物膜，对多种抗生素产生耐药性。目前用于治疗C. acnes PJI 的常用抗生素，如利福平（rifampicin）和克林霉素（clindamycin），长期使用后疗效会降低，因此急需开发新的抗菌策略。

宿主防御肽（host defense peptides，HDPs）是一类具有抗菌和免疫调节特性的短肽，其合成类似物展现出良好的抗生物膜活性，且对哺乳动物细胞毒性低，有望成为治疗 PJI 相关感染的新选择。然而，此前针对 HDPs 治疗C. acnes感染的研究较少，尤其是针对非口腔厌氧菌感染的研究，本研究旨在填补这一空白。

材料与方法

1. 细菌菌株培养：从患者体内分离出临床C. acnes菌株，通过质谱鉴定，分为非 PJI 相关菌株（C2 和 C5）和 PJI 相关菌株（PJI2 和 PJI8）。利用多基因座序列分型（MLST）技术对菌株进行分析，确定其序列分型、克隆复合体 MLST 和系统发育型。菌株在含 5% 羊血的哥伦比亚琼脂培养基上分离，在脑心浸液（BHI）肉汤中于厌氧条件下 37°C 培养 5 天。
2. 抗菌分子：选择由 D - 氨基酸组成的肽进行初步筛选，包括 DJK5、AB008-D、AB009-D、AB101-D 和 1018。这些肽通过标准固相 9 - 芴甲氧羰基化学合成，经反相高效液相色谱纯化至纯度 > 95%，并通过质谱确认身份。同时选择临床常用的两种抗生素克林霉素和利福平用于后续实验。
3. 抗菌活性测定：采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）和最小生物膜抑制浓度（MBIC）。在 48 孔板中进行实验，将肽添加到含稀释细菌的 BHI 培养基中，厌氧培养 5 - 6 天，观察细菌生长情况。通过结晶紫染色法测定生物膜量，以确定 MBIC。
4. 细菌粘附实验：在 24 孔板中，将细菌接种到含有不同浓度肽的 BHI 培养基中，分别使用 Thermanox 盖玻片或钛盘作为支持物。厌氧培养 6 天后，通过超声处理和涡旋振荡使附着和生物膜内的细菌脱离，然后进行平板计数，测定粘附细菌数量。
5. 生物膜根除实验：细菌在支持物上培养 5 天形成生物膜后，去除上清液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后加入含或不含肽（MIC 或 MBC 浓度）的 BHI 培养基，继续厌氧培养 16 小时。再次洗涤后，按照细菌粘附实验的方法计数回收的菌落形成单位（CFU）。
6. 扫描电子显微镜观察：将培养 5 - 6 天的细菌用肽处理后，用 PBS 洗涤，固定在 1% 戊二醛中，经梯度乙醇脱水，用六甲基二硅氮烷干燥，溅射金钯薄膜后，用扫描电子显微镜观察细菌形态，并用 ImageJ 软件测量细菌长度。
7. 肽对成骨细胞的影响
   • 细菌内化实验：将 Saos-2 成骨细胞接种在 24 孔板中，培养 72 小时后，用含或不含肽（MIC 浓度）的培养基处理，同时加入C. acnes细菌，感染复数（MOI）为 100:1。共培养 3 小时后，收集上清液进行平板计数，用庆大霉素杀死未内化的细菌，裂解细胞后计数内化细菌数量，计算内化细菌百分比。
   • 肽细胞毒性实验：使用乳酸脱氢酶（LDH）活性检测试剂盒评估肽对成骨细胞的细胞毒性。收集肽与 Saos-2 细胞共培养 3 小时后的上清液，过滤后与比色染料底物孵育，测量吸光度，以未处理细胞为对照，观察 LDH 释放情况。
8. 协同试验：测定克林霉素和利福平对所有C. acnes菌株的 MIC、MBC 和 MBIC。将肽和抗生素以不同浓度组合添加到 48 孔板中，接种细菌后厌氧培养 5 天，通过计算分数抑菌浓度（FIC）评估联合作用效果。对有协同作用的组合条件进行多次实验验证。
9. 数据处理与分析：实验结果以直方图表示，平均值和误差条表示标准偏差。使用 GraphPad Prism 软件进行精确的双尾非参数 Wilcoxon-Mann-Whitney 检验，P < 0.05 表示差异有统计学意义。

研究结果

1. 合成 D - 氨基酸 HDPs 对C. acnes生长的影响：DJK5、AB009-D 和 AB101-D 对浮游细菌有类似的抑制效果，MIC 为 16 - 32 μg/mL，MBC 约为 MIC 的两倍。AB008-D 和 1018 在实验条件下大多无活性。所有肽对生物膜形成均有抑制作用，其中 DJK5、AB009-D 和 AB101-D 的活性更强，其 MBIC 等于或低于 MIC。与临床常用抗生素相比，这些肽的作用浓度与克林霉素相近，利福平在较低浓度下对C. acnes生长有抑制作用，但除 PJI8 菌株外，在测试条件下无杀菌作用。基于这些结果，选择 DJK5、AB009-D 和 AB101-D 进行进一步研究。
2. D - 氨基酸 HDPs 对C. acnes粘附的影响：肽处理显著降低了细菌在塑料和钛支持物上的粘附，呈剂量依赖性。DJK5 在所有菌株中表现出最强的抗粘附性能，在 32 μg/mL 时，对所有菌株的粘附细菌数量有显著降低。AB009-D 和 AB101-D 对 PJI 相关菌株的粘附也有显著抑制作用。在 64 μg/mL 时，DJK5 和 AB009-D 对所有C. acnes菌株的粘附抑制效果最为明显，可使细菌粘附量降低约 2 个对数级。
3. D - 氨基酸 HDPs 对C. acnes形态的影响：扫描电子显微镜观察发现，肽处理 5 天后，C. acnes细胞形态发生改变，细菌细胞长度显著增加，尤其是非 PJI 相关菌株 C2。这表明肽可能影响了细菌的细胞分裂过程。
4. D - 氨基酸 HDPs 对成熟生物膜活力的影响：用接近 MIC 浓度（16 μg/mL 和 32 μg/mL）的 D - 氨基酸 HDPs 处理 5 天的成熟生物膜 16 小时后，AB101-D 对大多数菌株的生物膜细菌数量有显著降低，而 DJK5 和 AB009-D 仅对 PJI8 菌株有明显效果，PJI2 菌株的生物膜对所有肽均有抗性。总体而言，AB101-D 对预先形成的C. acnes生物膜具有最强的抗生物膜活性。
5. D - 氨基酸 HDPs 对C. acnes内化的影响：在肽存在的情况下，AB009-D 和 AB101-D 显著降低了细胞外细菌数量，DJK5 对细胞外细菌数量无显著影响，但抑制了 C2 和 PJI2 菌株被成骨细胞内化的数量。AB009-D 和 AB101-D 导致内化率降低可能是由于其对浮游细菌的快速杀菌作用，而 DJK5 抑制内化的机制可能与对细胞外细菌生长的影响无关。
6. 抗生素与 D - 氨基酸合成 HDP 联合治疗的效果：联合治疗实验表明，大多数情况下肽与抗生素组合表现为中性作用，仅在 C2 菌株中，4 ng/mL 的利福平和 16 μg/mL 的 AB009-D 组合对C. acnes生长有轻微的相加作用。CFU 计数验证了这种相加作用，联合治疗显著降低了浮游和附着阶段的细菌浓度。

讨论

C. acnes PJI 的治疗面临诸多挑战，包括手术治疗和长期抗生素治疗导致的抗生素耐药性问题。生物膜形成和细菌内化是感染持续存在的重要原因。本研究中，三种合成 D - 氨基酸肽（DJK5、AB009-D 和 AB101-D）对C. acnes表现出抗菌和抗生物膜活性，且具有不同的作用特点。DJK5 抑制生物膜起始形成和细菌内化，AB009-D 有效预防生物膜起始，AB101-D 对预先形成的生物膜效果显著。

这些肽的 MBIC 等于或低于 MIC，表明其对生物膜内细菌具有选择性活性，可能与浮游细菌和生物膜内细菌的代谢差异有关。肽处理导致C. acnes细胞长度增加，推测可能与影响细胞分裂相关蛋白 FtsZ 有关，但具体机制尚待进一步研究。

在联合治疗方面，AB009-D 与利福平的组合对部分菌株有相加作用，这表明肽与抗生素联合使用可能增强治疗效果，减少抗生素用量，降低抗生素耐药性风险。然而，该效果需要在更多C. acnes菌株中验证，同时也需要优化肽序列以更好地针对C. acnes的粘附和生物膜形成。

综上所述，合成 D - 氨基酸 HDPs 在对抗C. acnes感染方面展现出潜力，但不同肽对不同菌株的活性存在差异。未来可通过优化肽序列，使其更有效地预防C. acnes在 PJI 感染条件下的生长，或针对细胞内的C. acnes，为C. acnes相关 PJI 的治疗提供新的选择。