A 组链球菌（GAS）半胱氨酸蛋白酶 SpeB 修饰 IgA：潜在的黏膜免疫逃逸新机制

《Microbiology Spectrum 3.7》：Group A streptococcal SpeB modifies IgA through targeting regions other than the hinge

这篇研究聚焦 A 组链球菌（GAS）分泌的半胱氨酸蛋白酶 SpeB 与 IgA 的相互作用。发现 SpeB 可修饰 IgA，导致多聚体 / 二聚体形式丧失，主要影响 IgA2，且修饰位点可能在 C 端。这一发现为 GAS 免疫逃逸机制研究提供了新视角，值得关注。

　　### 摘要
免疫球蛋白（Ig）的降解是细菌重要的免疫逃逸策略。对于黏膜定植而言，IgA 的降解尤为关键，许多细菌会分泌特异性 IgA 蛋白酶，通常靶向 IgA1 的延伸铰链区。尽管 A 组链球菌（Group A Streptococcus，GAS）能够成功定植于人类黏膜表面，但目前尚未在其中发现这种特殊的 IgA 蛋白酶。本研究聚焦于 GAS 分泌的半胱氨酸蛋白酶 SpeB，分析其与 IgA 的相互作用。通过野生型和 speB 基因缺失的同基因突变株的细菌上清液以及重组 SpeB 进行实验，结果显示出一种依赖 SpeB 的 IgA 修饰活性。SpeB 可导致多聚体 IgA 的降解，包括二聚体形式，在 IgA2 中表现最为显著。修饰产物的大小小于重链，表明这是一种不同于经典铰链区切割的修饰方式。质谱分析和糖基化谱表明，推测切割位点位于 C 端区域，影响尾片，导致高分子量的多聚体 / 二聚体形式的 IgA 丢失。鉴于二聚体 IgA 在黏膜表面的重要性，未来有必要进一步研究 SpeB 对 IgA 的修饰是否代表 GAS 在该部位的免疫逃逸机制。

重要性

A 组链球菌（GAS）是一种重要的人类病原体，能够高效定植于黏膜表面，并引发从咽扁桃体炎到严重侵袭性感染或链球菌感染后后遗症等一系列疾病。免疫球蛋白（Ig），尤其是 IgA，是抵御病原体在黏膜表面定植的关键效应分子。在本研究中，研究人员关注 GAS 分泌的半胱氨酸蛋白酶 SpeB，并探究其与人类 IgA 的相互作用。研究发现，SpeB 依赖的 IgA 修饰会导致 IgA 的多聚体 / 二聚体形式丢失，主要影响 IgA2。推测的修饰区域是 IgA 的 C 端，这与靶向铰链区的特异性 IgA 蛋白酶的切割位点不同。这些发现表明，SpeB 对 IgA 的修饰可能是 GAS 定植人类黏膜组织时利用的一种免疫逃逸策略。

引言

A 组链球菌（GAS）是一种严格寄生于人类的病原体，它可以定植于上呼吸道和皮肤，导致无症状携带，或引发咽炎、脓疱病等浅表、不复杂的感染，也可能引发菌血症、链球菌中毒性休克综合征和坏死性软组织感染等严重、可能危及生命的侵袭性疾病。

GAS 进化出了多种免疫逃逸机制，针对补体系统、抗菌因子、细胞因子、趋化因子和免疫球蛋白（Ig）等。其中针对 Ig 的毒力因子包括特征明确的半胱氨酸蛋白酶 IdeS 和内切糖苷酶 EndoS，它们专门修饰 IgG。IdeS 在 IgG 的铰链区切割，损害调理吞噬作用；EndoS 水解 IgG 重链（HC）上的核心聚糖，使 GAS 在血液中的存活率提高。

IgA 特异性蛋白酶是呼吸道定植菌和病原体常见的毒力因子，这些蛋白酶通常靶向 IgA1 的延伸铰链区。由于 IgA2 缺乏这种结构，因此对切割的敏感性较低。被切割的完整 Fab 部分仍能结合抗原，但 Fc 介导的效应功能，如抗体介导的凝集和调理吞噬作用会受到抑制。许多口腔和咽部的定植菌，如血链球菌、口腔链球菌、缓症链球菌，以及脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌等病原菌都有 IgA1 蛋白酶。在 GAS 中，半胱氨酸蛋白酶 SpeB 是否能切割 IgA 存在争议，有两项研究得出了相反的结论。在本研究中，研究人员分析了 SpeB 与人类 IgA 的相互作用，发现人类血清 IgA 在生理条件下会被 SpeB 修饰，且 SpeB 切割导致 IgA 的多聚体 / 二聚体形式丢失，主要影响 IgA2。

材料和方法

1. 细菌菌株和生长条件：GAS 菌株 5448 分离自一名侵袭性感染患者，其 speB 基因缺失的同基因突变株通过等位基因交换诱变产生。两种菌株均由 Malak Kotb 博士提供，在添加 1.5% 酵母提取物的托德?休伊特肉汤（Todd Hewitt broth supplemented with 1.5% yeast extract，THY）中 37°C 培养至稳定期。
2. 硫酸铵沉淀：将 25mL 细菌过夜培养物离心，收集上清液在 4°C 进行沉淀。向搅拌的上清液中逐滴加入 25mL 4M 硫酸铵，继续搅拌 3.5 小时。将沉淀的上清液在 4°C、20,000×g 离心 15 分钟，沉淀用 1mL PBS 重悬，通过 Zeba Spin Micro Desalting Columns（赛默飞世尔科技）进行缓冲液交换，浓缩后的上清液储存于 -80°C。
3. 使用 GAS 上清液进行 Ig 降解实验：按照上述方法通过硫酸铵沉淀制备来自稳定期细菌培养物的浓缩细菌上清液。将 10μg 人血清 IgA（西格玛 - 奥德里奇公司）与 1:5 稀释的浓缩上清液在 PBS 中 37°C 孵育 16 小时，样品储存于 -20°C。在与人类血清 IgA 孵育前，蛋白酶抑制剂（Protease Inhibitors Set 786 - 207，G - Biosciences）以最高推荐工作浓度与浓缩上清液单独孵育 15 分钟。
4. 使用重组 SpeB 进行 Ig 降解实验：重组 SpeB（rSpeB，FabULOUS Genovis）用 5mM 二硫苏糖醇（DTT）在 37°C 孵育 30 分钟进行激活，之后用 Zeba Spin Micro Desalting Column（赛默飞世尔科技）去除 DTT 两次，以避免 IgA 内二硫键的还原。为控制 DTT 完全去除，制备一个对照样品，用蒸馏水代替 rSpeB，按照上述相同步骤处理。将激活的 rSpeB 或对照与人类血清 IgA、天然人类 IgA1 蛋白（ab91020；Abcam）或人类天然 IgA2 蛋白（ab91021；Abcam）以 6U rSpeB/μg IgA 的比例混合，在 37°C 孵育 2 小时。为研究 rSpeB 在全人血清（Biowest）中对 IgA 的活性，将激活的 rSpeB（0.2、1 和 5U/μL）或对照在 2% 人血清中 37°C 孵育 16 小时，样品储存于 -20°C 直至进一步处理。
5. SDS - PAGE 和蛋白质免疫印迹分析：用于 SDS - PAGE 的样品使用 NuPAGE^TM LDS 样品缓冲液（赛默飞世尔科技旗下 Invitrogen 产品）制备，在还原条件下添加 NuPAGE 样品还原剂（Invitrogen），70°C 加热 10 分钟。将样品和 PageRuler Plus 预染蛋白分子量标准（赛默飞世尔科技）加载到 10% 或 4 - 12% NuPAGE Bis - Tris 凝胶（Invitrogen）上进行电泳分离。凝胶按照制造商说明用 Imperial Protein Stain（赛默飞世尔科技）染色，或使用 iBlot2 干式转印系统（Invitrogen）转移到硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。转移后，膜在含 0.05% 吐温的 5% 牛奶 TBS（TBS - T）中封闭 1 小时，然后在含 1% 牛奶的 TBS - T 中与一抗孵育 1 小时。膜洗涤后，再与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗孵育 1 小时。使用的抗体稀释度为：1:5,000 抗人 IgA - HRP（A18781，Invitrogen）和 1:2,000 抗 SpeB（ab225941，Abcam）。使用 ChemiDoc XRS + 系统（伯乐公司）或 Odyssey Fc 成像仪（LI - COR）进行条带检测。
6. 肽质量指纹图谱分析：按照上述方法用 rSpeB 处理人血清 IgA，降解反应在 37°C 孵育 24 小时。通过还原 SDS - PAGE 分离并染色后，从 SDS - PAGE 凝胶上紧密切下三个比重链（HC）小的切割产物条带，以及未处理 IgA 的 HC 条带。将凝胶条带切成 1mm 的小块，使用 ProGest Investigator 胶内消化机器人（Genomic Solutions，美国密歇根州安娜堡）进行胶内消化。凝胶小块用 50% 乙腈洗涤脱色，用 5mM DTT 在 56°C 还原 30 分钟，用 10mM 碘乙酰胺烷基化 30 分钟，然后每个样品用 0.002μg 胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶在 37°C 消化过夜。用 5%（v/v）甲酸提取肽，通过离心蒸发（Thermo Savant SpeedVac，赛默飞世尔科技）浓缩至 20μL。两组样品分别在切下感兴趣的凝胶条带后或在 SDS - PAGE 之前进行去糖基化处理。对于胶内去糖基化，凝胶块用 50% 乙腈洗涤脱色，然后用乙腈收缩，再浸泡在含有 50mM NaCl 和 5mM EDTA 的 20mM Tris 缓冲液（pH 7.5）中。加入快速肽 N - 糖苷酶 F（Rapid PNGase F，New England Biolabs），在 50°C 孵育 2 小时。然后按照下面描述的方法处理凝胶条带进行消化。对于溶液内去糖基化，16μg 人血清 IgA 按照制造商的两步方案与 2.5μL Rapid PNGase F 孵育，然后进行还原 SDS - PAGE。取 1 - 10μL 样品（根据原始条带的染色强度估计）注入反相 PepMap 捕集柱（75μm×20mm，赛默飞世尔科技）进行预浓缩，用加载溶剂（含 0.05%（v/v）三氟乙酸的水）以 5μL/min 的流速冲洗 10 分钟进行脱盐。然后将肽捕集柱与 EASY - spray ES900 柱（75μm×150mm，3μm 粒径）串联。使用线性溶剂梯度洗脱肽：在 120 分钟内从 4% - 40% 的溶剂 B，30 分钟内从 40% - 60% 的溶剂 B，在 0.1 分钟内急剧增加到 95% 溶剂 B，在 95% 溶剂 B 下等度保持 15 分钟，在 0.1 分钟内急剧下降到 2% 溶剂 B，在 2% 溶剂 B 下等度保持 15 分钟。溶剂 A 是含 0.1%（v/v）甲酸的水，溶剂 B 是 80%（v/v）乙腈、20% 水和 0.1% 甲酸。赛默飞世尔科技的 Fusion Lumos 质谱仪在数据依赖采集（DDA）正离子模式下运行，循环时间为 1.5 秒。选择 Orbitrap 作为 MS1 检测器，分辨率为 120,000，扫描范围为 m/z 350 - 2,000。在 DDA 条件下选择电荷态为 2 - 7 的肽进行碎片化，一次出现后排除 10 秒。通过高能碰撞解离（HCD）和电子转移解离（ETD）进行碎片化，不同电荷态的电子转移 / 捕获（ETC）反应时间分别为 60ms（2 - 3+）、40ms（4+）和 20ms（5 - 7+），在 Orbitrap 中以 30,000 的分辨率进行测量。使用 Mascot 软件搜索数据文件，选择胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶作为切割酶，半胱氨酸的氨甲酰甲基化作为固定修饰。包括天冬酰胺转化为天冬氨酸（去糖基化的结果）和甲硫氨酸氧化的可变修饰。将光谱与包含 6,012 个蛋白质序列的内部数据库进行比对，并添加来自结构模型 pdb 1iga 的 IgA1 序列（HC_IgA1）和来自 UniProt 条目 P0DOX2 的 IgA2 序列（HC_IgA2）。肽质量容差为 20ppm，片段质量容差为 0.1Da。
7. 凝集素印迹分析：按照上述方法用 rSpeB 处理人血清 IgA，通过还原 SDS - PAGE 分离后转移到 PVDF 膜上。封闭后，膜在 4°C 与 10μg/mL 生物素化的接骨木凝集素（Sambucus nigra lectin，SNA；结合唾液酸残基）、20μg/mL 生物素化的小扁豆凝集素（Lens culinaris agglutinin，LCA；结合岩藻糖基化的三甘露糖聚糖）或 5μg/mL 生物素化的鸡冠刺桐凝集素（Erythrina crista - galli lectin，ECL；结合半乳糖）（均来自 Vector laboratories）孵育过夜。使用 HRP 标记的链霉亲和素（1:500，R&D）作为二抗，用 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate（赛默飞世尔科技）进行显影。按照制造商的两步方案使用 Rapid PNGase F（New England Biolabs）制备去糖基化的人血清 IgA。
8. 凝集素 ELISA 分析：在 96 孔板中，用 0.05M 碳酸盐 - 碳酸氢盐偶联缓冲液（pH 9.6）将 5μg/mL 的 IgA、经 rSpeB 处理的 IgA 或单独的 rSpeB 在 4°C 包被过夜。用含 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS - T 在室温下封闭非特异性结合位点 2 小时。之后，孔中加入 5μg/mL 的凝集素（见凝集素印迹）在含 1% BSA 的 PBS - T 中孵育，然后加入链霉亲和素 - HRP（R&D Systems）孵育 1 小时。在每次抗体孵育之间用 PBS - T 充分洗涤板，使用 TMB 底物试剂套装（BD）进行检测。用 1M 硫酸终止反应，使用酶标仪在 450nm 和 570nm 处测量吸光度。

结果

1. GAS 以 SpeB 依赖的方式修饰 IgA：为研究 GAS 在非还原条件下对人血清 IgA 的潜在切割作用，研究人员使用了 GAS 菌株 5448（一种特征明确的侵袭性 emm1 分离株）及其 speB 基因缺失的同基因突变株 5448ΔspeB 过夜培养物的上清液。对细菌上清液的蛋白质免疫印迹分析证实 GAS 5448 表达 SpeB，包括成熟的蛋白水解形式。SDS - PAGE 分析显示，与未处理的 IgA 相比，用 5448 浓缩上清液处理的 IgA，高分子量形式（包括二聚体形式）丢失，同时出现质量约为 75kDa（可能对应重链（HC）和轻链（LC））的增强条带以及新出现的质量约为 55kDa（符合 HC 单体预期质量）的条带。相比之下，5448ΔspeB 的浓缩细菌上清液无法修饰 IgA。由于 SpeB 是一种半胱氨酸蛋白酶，研究人员测试了一组蛋白酶抑制剂，结果表明四种半胱氨酸蛋白酶抑制剂（盐酸抗蛋白酶、E64、抑糜蛋白酶和亮肽素）完全抑制了 IgA 的切割，而其他蛋白酶抑制剂没有效果，进一步支持了 SpeB 依赖的作用。

为进一步评估 SpeB 对 IgA 的修饰作用，研究人员将重组 SpeB（rSpeB）与人血清 IgA、纯化的 IgA1 或纯化的 IgA2 孵育。人血清 IgA 在 rSpeB 处理后显示出与 5448 上清液处理相似但更明显的切割现象。IgA1 和 IgA2 呈现出不同的切割模式，IgA1 中多聚体（2HC）条带丢失，而 IgA2 中 2HC 条带保持完整，但二聚体形式丢失，同时出现 55kDa 和 75kDa 的增强条带。为减少链间寡聚化对条带模式的影响，研究人员使用还原 SDS - PAGE 凝胶分离进一步评估 rSpeB 对 IgA 的蛋白水解切割，观察到三个表观质量低于 HC 的蛋白条带。IgA 的修饰产物仅比 HC 略小（约 55 - 60kDa），表明 SpeB 不靶向铰链区。此外，rSpeB 在全人血清中的活性显示出浓度依赖性的 IgA 切割作用。
2. SpeB 切割导致 IgA 的 C 端区域丢失：高分子量形式的 IgA 降解表明 SpeB 倾向于切割多聚体血清 IgA，并影响其二聚化。修饰产物的大小小于 HC，表明这是一种不同于经典铰链区切割的修饰方式。为深入了解 SpeB 在 IgA 中的切割位点，研究人员对三个较小的修饰产物（用星号标记）的切下凝胶条带进行质谱（MS）分析。为最大限度地覆盖 IgA 序列进行肽质量指纹图谱分析，研究人员使用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶进行胶内消化，并通过用去糖基化酶 PNGase F 对样品进行胶内和溶液内消化进一步扩展覆盖范围。由于 IgA 重链可变区（HC）序列信息稀缺以及血清 IgA 的多克隆性质，分析受到限制。在所有分析的凝胶条带中均检测到 IgA1 和 IgA2 的特异性序列。未获得 IgA1 可变 HC 结构域的覆盖信息，但在溶液内 PNGase F / 胰蛋白酶消化的所有分析条带中均观察到与 IgA2 匹配的独特 N 端肽，这表明所有观察到的片段均来自 rSpe<