音乐干预新发现：调节肠道微生物群，对抗沙门氏菌感染

《Microbiology Spectrum 3.7》：Music exposure enhances resistance to Salmonella infection by promoting healthy gut microbiota

这篇研究发现，音乐可通过调节肠道微生物群（gut microbiota）组成，增强小鼠对沙门氏菌（Salmonella）感染的抵抗力。莫扎特音乐能增加有益菌唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius），改善小鼠行为和代谢。这为音乐疗法防治感染性疾病提供了理论依据。

　　

音乐干预与肠道微生物群及健康关系的研究

在生命科学和健康医学领域，肠道微生物群（gut microbiota）对人体健康的重要性日益受到关注。它存在于人类和其他哺乳动物的胃肠道中，由数万亿微生物组成，对宿主的生理功能有着深远影响。不仅能从饮食中提取营养和能量，还能抵御肠道病原体、促进免疫系统发育和维持代谢平衡，其失衡与多种疾病相关 。沙门氏菌（Salmonella enterica）作为常见的食源性致病菌，是全球范围内导致腹泻疾病的主要原因之一。近年来，抗生素耐药性问题愈发严重，耐药沙门氏菌感染病例不断增加，给公共卫生带来巨大挑战。寻找新的治疗策略和深入了解沙门氏菌在肠道内的致病机制迫在眉睫。

音乐疗法作为一种非侵入性、低成本的治疗方式，在临床应用中逐渐受到认可。已有研究表明，听音乐能引发人体特定的生理变化，如激活大脑边缘系统的愉悦区域，促使多巴胺、内源性阿片肽等神经肽释放，还具有降低血压、减轻焦虑和疼痛、增强免疫功能等益处。然而，音乐对肠道微生物群的影响尚不明确。基于音乐能影响神经肽释放，研究人员提出假设：古典音乐可能正向调节肠道微生物群组成。本研究旨在通过小鼠模型验证这一假设，探索音乐疗法在改善肠道健康和预防感染方面的潜力。

材料与方法

研究选用了多种细菌菌株，包括来自宾夕法尼亚大学 Sunny Shin 实验室的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344，简称 Salmonella 或 STm ），以及从美国典型培养物保藏中心（ATCC）购买的唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius，ATCC11741）和格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri，ATCC33323） 。不同细菌在特定培养基中培养，Salmonella 在含 100 μg/mL 链霉素的 LB 培养基中、37°C 条件下培养；乳杆菌在 MRS 培养基中、37°C 培养；固体培养基添加 1.5% 琼脂，半固体培养基添加 0.3% 琼脂；当 Salmonella 和 Lactobacillus 共培养时，使用 1:1 混合的 LB-MRS 培养基。

实验选用 6 周龄成年 CD-1 雌性小鼠，分为三组。选择雌性小鼠是因其性情温顺，便于实验操作和减少应激因素干扰。对照组（Group 1）不接受额外声音处理，环境噪音水平在 63 - 70 dB；实验组（Group 2）每天在白天 12 小时光照 / 12 小时黑暗循环中，暴露于莫扎特 D 大调长笛四重奏（65 - 75 dB）；另一组（Group 3）仅暴露于 70 dB 的白噪音 12 小时。

对小鼠进行 Salmonella 感染实验时，先让小鼠禁食过夜，然后口服接种 10⁸个 Salmonella，在感染前 20 分钟注射 50 μL 0.5 M NaHCO₃中和胃酸。收集小鼠粪便，用 BeadBeater 在生理盐水中匀浆，通过梯度稀释和在含链霉素（100 μg/mL）的 LB 琼脂平板上培养，测定 Salmonella 的定植量（以菌落形成单位 CFU 表示）。

在研究 L. salivarius 定植时，小鼠先饮用含 1 mg/mL 链霉素的水 3 天，以耗尽内源性共生微生物，且 L. salivarius 对链霉素天然耐药。之后，每天给小鼠灌胃接种 10⁹ CFU/mouse 的 L. salivarius，持续 3 天。通过对小鼠粪便匀浆梯度稀释，并在含 100 μg/mL 链霉素的 MRS 琼脂平板上培养，定量检测 L. salivarius 的定植情况。

采用矩形开放场（20×15 英寸）进行小鼠行为测试。在旷场实验（Open Field Test，OFT）中，小鼠从同一角落释放，单独测试，每次测试持续 15 分钟，测试后用 70% 乙醇清洁场地，通过 MATLAB 脚本 MouseActivity 计算趋壁行为（thigmotaxis，即小鼠在场地边缘停留时间占总时间的比例）和移动距离。物体定位任务（Object Location Task，OLT）中，小鼠先在测试房间适应 30 分钟，进行训练试验，让其探索场地和两个固定位置的物体 10 分钟，然后放回清洁笼中 20 分钟，再次放回场地探索 10 分钟，之后再放回笼中 20 分钟。正式测试时，移动其中一个物体，小鼠再次探索 10 分钟，每次试验间用 70% 乙醇擦拭场地和物体以消除嗅觉线索，通过 MouseActivity 脚本确定小鼠在每个物体周围 1.5 cm 区域的探索时间，计算新物体探索时间占总探索时间的百分比。

分别在声音暴露前（T0）和暴露 3 周后、Salmonella 感染前（T1）收集小鼠粪便。通过珠磨法物理破碎粪便，经酚 - 氯仿处理提取 DNA。使用 515F（GTG^CAGCMGCCGCGGTAA）和 806R（GGACTAC^HVGGGTWTCTAAT）引物扩增 16S 核糖体 RNA 基因的 V4 可变区，利用 Illumina MiSeq 平台进行测序，测序读长为 2×150 bp，使用 QIIME2 - 2021.4 和 VEGAN 软件分析数据。

在体外共培养实验中，Lactobacillus 菌株在 MRS 培养基中 37°C 静置培养，Salmonella 在 LB 培养基中 37°C 振荡培养。共培养时使用 1:1 混合的 MRS 和 LB 培养基，用 pH 计测量培养基 pH，在半固体培养基中添加 0.1% 溴甲酚紫作为 pH 指示剂。

取新鲜小鼠粪便（200±10 mg），用甲醇通过珠磨法提取。蒸发溶剂后，样品溶解在 40 μL 50/50（体积比）的水 / 乙腈溶液中。对于短链脂肪酸（SCFA）分析，样品按照既定方案用 EDC/Hobt/ 苯胺进行柱前衍生化，同时处理真实标准品并同步分析。使用 Waters Acquity I - class UPLC 系统和 Waters Synapt G2Si HDMS 质谱 QTOF 仪，在正离子模式下、加热电喷雾电离（ESI）源条件下进行分析。在 Waters Acquity UPLC BEH C₁₈ 1.7 μm 2.1×50 mm 色谱柱上分离，流动相 A 为含 0.1%（体积比）甲酸的水，B 为含 0.1%（体积比）甲酸的乙腈，以 0.6 mL/min 的流速在 4 分钟内从 95/5 到 15/85 A/B 进行梯度洗脱。数据以 MSe 模式收集，从 TOF MS TICs 中提取质量，质量提取宽度为 0.005 Da 绝对宽度，利用 VEGAN 软件分析整体代谢物谱的 β 多样性。

所有统计分析均使用 GraphPad Prism 软件（版本 10），数据以平均值 ± 标准差（SD）表示，除非另有说明。以 P < 0.05 为具有统计学意义，图表展示个体数据点、平均值和标准差 / 标准误差（SEM）的误差条，各分析的样本量（n）和具体统计检验方法在相应图注中详细说明。

实验结果

通过对小鼠粪便微生物群落 16S rRNA 基因测序分析发现，音乐处理显著改变了肠道微生物群的组成。3 周后，不同声音处理组的粪便微生物群落结构出现明显聚类。其中，Lactobacillus 属的物种相对丰度受声音处理类型影响显著，尤其是 L. salivarius。在接受莫扎特音乐处理的小鼠中，部分个体的 L. salivarius 相对丰度接近 60%，而对照组（环境噪音组 AN 和白噪音组 WN）仅接近 10% ，其他非 Lactobacillus 属且相对丰度大于 1% 的物种在声音处理 3 周后未表现出与声音相关的差异。

在声音处理期间，三组小鼠体重均逐渐增加，组间无显著差异，表明不同声音暴露对小鼠基线健康状况影响较小。对经 3 周音乐暴露后的小鼠进行 Salmonella 感染实验，感染 1 天后，AN 组和 WN 组小鼠体重下降约 10%，符合正常 Salmonella 感染的症状，且该差异在感染后第 1 天具有统计学意义，但在第 3 天和第 5 天消失；莫扎特组小鼠感染后体重无显著下降。同时，感染 1 天后，莫扎特组小鼠体内 Salmonella 定植数量低于 AN 组和 WN 组；第 3 天，三组小鼠体内 Salmonella 定植均减少。这表明音乐对小鼠具有积极影响，可能有助于抵抗细菌感染，且莫扎特组小鼠对 Salmonella 感染的抵抗力增强可能与 L. salivarius 数量增加有关。

为进一步探究 L. salivarius 对 Salmonella 感染的影响，在耗尽小鼠内源性共生微生物后，分别给小鼠接种 PBS 缓冲液或 L. salivarius，2 天后再接种 Salmonella。结果发现，预先定植 L. salivarius 的小鼠，其体内 Salmonella 定植显著减少，说明 L. salivarius 能预防小鼠肠道 Salmonella 感染。在体外共培养实验中，L. salivarius 有效抑制了 Salmonella 的生长，且随着 L. salivarius 数量增加，抑制作用增强。研究还发现，L. salivarius 能使培养基 pH 迅速下降至 4，而 Salmonella 单独培养或与 L. gasseri 共培养时，培养基 pH 仅逐渐降至 5 左右。在含有 pH 指示剂的软琼脂平板实验中，L. salivarius 周围出现明显抑菌圈，对应培养基低 pH 区域，而 L. gasseri 对培养基 pH 和 Salmonella 生长影响较小。将 L. salivarius 的无细胞上清液（pH 约 4）和 pH 调至 6.5 的上清液分别用于培养 Salmonella，发现原上清液显著抑制 Salmonella 生长，而 pH 调整后的上清液抑制作用明显减弱，表明 L. salivarius 通过酸化培养基抑制 Salmonella 生长，但可能还存在其他抑制机制。

在验证音乐对 L. salivarius 定植的影响实验中，先给小鼠使用链霉素减少正常肠道菌群，然后口服接种 L. salivarius，待其稳定定植后，一组小鼠暴露于莫扎特音乐，另一组暴露于白噪音。实验初期，两组小鼠 L. salivarius 定植水平相似；10 天后，音乐暴露组 L. salivarius 水平保持较高，而白噪音组开始下降；3 周后，白噪音组 L. salivarius 检测不到，音乐暴露组仍保持高定植水平；停止音乐处理 1 周后，原音乐暴露组 L. salivarius 水平迅速下降。这表明音乐暴露能显著增强 L. salivarius 的定植。

在行为学测试中，观察发现莫扎特组小鼠比对照组更活跃。进一步测量发现，莫扎特组小鼠每日食物摄入量显著高于白噪音组。旷场实验结果显示，莫扎特组小鼠趋壁行为低于白噪音组，表明其更具探索性、焦虑程度更低；物体定位任务中，莫扎特组小鼠在探索移动后的物体上花费更多时间，说明其空间记忆能力更好。综合表明，莫扎特音乐暴露使小鼠更活跃、焦虑程度降低且空间记忆能力提升。

通过代谢组学分析发现，音乐暴露改变了小鼠肠道代谢物景观。在处理 3 周后，莫扎特组和白噪音组小鼠粪便代谢物谱通过主坐标分析（PCoA）出现明显分离和分组，表明两组间代谢物类型和丰度存在显著差异；但在停止处理 1 周后，这种差异消失。这说明音乐可能通过改变微生物活性、组成或宿主代谢来影响肠道生理。

研究讨论

大量研究证实音乐疗法在临床环境中具有诸多益处，如减轻压力、降低血压、增强免疫系统和改善疼痛管理等，但此前音乐对肠道微生物群组成和病原体抵抗力的影响尚未明确。本研究利用小鼠模型发现，音乐暴露可显著改变肠道微生物群，增加有益菌 L. salivarius 数量，减少 Salmonella 定植，同时改善小鼠行为，增强其空间记忆能力。虽然此前有研究报道音乐干预可改变小鼠肠道微生物组成，但本研究进一步揭示了音乐通过调节肠道微生物群改善健康和抵抗病原体的重要作用。

微生物抗生素耐药性是当前公共卫生面临的重大问题，新抗生素研发放缓，使得寻找新型抗菌策略迫在眉睫。益生菌作为一种潜在的抗菌策略，具有抑制病原体黏附、增强黏膜屏障功能和强化免疫系统等作用，但口服益生菌存在受宿主抗菌活动影响和与共生菌竞争导致活力降低的问题。本研究发现音乐能增加肠道中 L. salivarius 的丰度并延长其定植时间，这对于提高益生菌治疗效果、减少抗生素使用和预防抗生素耐药性具有重要意义。此外，音乐疗法成本效益高，基于音乐的治疗或预防干预措施有助于促进健康公平。

本研究仅使用了莫扎特的 D 大调长笛四重奏进行实验，关于 “莫扎特效应” 存在争议。未来研究可测试其他类型的古典音乐（如浪漫主义、巴洛克、现代音乐）以及不同音乐流派，以确定病原体抵抗效应是否特定由莫扎特音乐引发，还可深入研究音乐的频率、节奏和节拍等具体元素对实验结果的影响。由于本研究仅使用了雌性小鼠，而有研究表明音乐的某些效应可能与雌性小鼠的卵巢类固醇有关，因此未来还需对雄性小鼠进行测试。

目前，莫扎特音乐暴露导致小鼠肠道中某些 Lactobacilli 数量增加的原因尚不明确。虽然已知肠道微生物群在宿主神经退行性疾病和心理健康中发挥重要作用，但宿主神经活动对肠道微生物群的影响机制尚不清楚。听音乐可激活大脑边缘系统的愉悦区域，释放神经肽，神经肽在神经系统内部以及神经系统与身体其他部分之间起重要介导作用，可能通过肠 - 脑轴影响胃肠道微生物群的活动及其与中枢神经系统的相互作用，从而在音乐暴露和肠道微生物群变化之间建立联系。莫扎特组小鼠更活跃、焦虑程度更低，肠道代谢物景观也发生改变，这些变化可能直接或间接提高了 L. salivarius 在肠道中的生存能力。未来还需更多研究来探究音乐暴露是否通过类似途径发挥作用，以及音乐增强特定益生菌或共生菌是否还有其他健康益处。