解析多复制子细菌奥秘：Pseudoalteromonas染色体与染色粒的突变及进化特征

《Microbiology Spectrum 3.7》：Mutational features of chromids and chromosomes in Pseudoalteromonas provide new insights into the evolution of secondary replicons

在多复制子细菌中，染色粒（chromids）的突变特征和进化模式尚不明晰。本文以Pseudoalteromonas属细菌为研究对象，通过比较基因组分析和突变积累测序（MA-WGS），揭示了染色体与染色粒在序列、突变等方面的异同，为理解细菌多样性和染色粒进化提供了新视角。

　　### 研究背景
在已公布基因组信息的细菌中，约 10% 为多复制子物种，其基因组包含初级复制子（染色体）和次级复制子（染色粒）。染色粒携带对生物体生长至关重要的基因，在基因组中占据重要地位，被认为起源于巨型质粒。

已有研究表明，多复制子物种中不同复制子的进化模式和基因突变率存在差异。例如，在Sinorhizobium meliloti中，染色体垂直传递且结构稳定，而染色粒由古老的水平基因转移形成，受到更强的正选择。不过，此前多数研究仅聚焦于基因组的部分序列或基因水平，在全基因组层面，对不同类型复制子的自发突变特征和进化模式的研究仍较为匮乏。

Pseudoalteromonas属是广泛分布于海洋环境的多复制子细菌，该属物种产生丰富的代谢产物，在生态环境中发挥重要作用，且其染色粒存在单向和双向复制两种模式，为研究复制子的突变特征和进化模式提供了独特的模型。

材料与方法

1. 基因组序列特征分析：从 NCBI 数据库下载 22 种已完全组装和注释的Pseudoalteromonas物种的全基因组序列，分析染色体和染色粒的 GC 含量、三核苷酸组成频率、编码序列（CDS）密度、GC 偏斜以及非同义（Ka）和同义（Ks）替换率等特征。
2. 系统发育树构建和共线性分析：利用 OrthoFinder 软件识别单拷贝直系同源基因，Mafft 软件进行氨基酸序列比对，IQ-TREE 软件基于最大似然原理构建系统发育树。选取不同进化分支的代表性物种，使用 MCScanX 软件进行基因共线性分析。
3. 染色粒复制方向验证：选择P. sp. LC0214（含单向复制染色粒）和P. sp. JCM12884^T（含双向复制染色粒），通过基因共线性分析和测序验证复制方向。具体步骤包括培养细胞、提取基因组 DNA、构建文库、测序，以及将测序数据比对到参考基因组计算碱基对覆盖度。
4. DNA 错配修复系统缺陷菌株构建：利用同源重组原理，通过无标记删除mutS基因，构建P. sp. LC0214 和P. sp. JCM12884^T的错配修复系统缺陷（ΔmutS）菌株。
5. 突变积累实验：对P. sp. LC0214 和P. sp. JCM12884^T的野生型（WT）和 ΔmutS菌株进行突变积累实验，每个菌株设置多个突变积累（MA）系，每日进行单菌落转接，持续 80 - 100 天。期间通过菌落形成单位估算细胞分裂次数。
6. DNA 提取、文库构建和全基因组测序：实验结束后，挑选每个 MA 系的单菌落和祖先系培养，提取基因组 DNA，构建插入片段约 300bp 的短读长文库，使用 Illumina NovaSeq6000 系统进行 PE150 测序。
7. 碱基对替换（BPS）和插入缺失（indel）突变分析：对测序数据进行质量控制，去除接头和低质量 reads，将清洁 reads 比对到参考基因组，使用 GATK 软件的 HaplotypeCaller 识别 BPS 和 indel 突变。计算突变率、A/T 突变偏向以及转换与颠换比率（ts/tv）等指标。

实验结果

1. 染色体和染色粒的序列组成：22 种Pseudoalteromonas物种中，P. aliena和P. rhizosphaerae只有初级复制子染色体，无染色粒，且这两个单复制子物种的染色体比多复制子物种的染色体更大。GC 偏斜分析显示，22 种物种的初级复制子染色体相对于复制起点和终点对称，部分物种的次级复制子染色粒也对称，表明其双向复制，而多数物种的染色粒不对称，为单向复制。

进一步分析发现，染色体和染色粒的 GC 含量差异不显著，三核苷酸组成中 AAA 和 TTT 的比例较高，染色粒的 CDS 密度显著低于染色体，染色体和染色粒上单拷贝同源基因的 Ka/Ks 值通常在 0 - 0.1 之间，表明这些基因受到强烈的负选择。
2. 系统发育树和基因共线性分析：系统发育树显示，具有双向复制染色粒的两个物种聚集在一个进化分支上，两个单复制子物种聚集在单向复制染色粒物种的分支内。染色体和染色粒的进化分支拓扑结构几乎相同，且染色粒的序列大小从单向复制到双向复制呈增加趋势。

基因共线性分析表明，染色粒的共线性区域从双向复制到单向复制逐渐增加，P. sp. JCM12884^T的染色体和染色粒与外群单复制子物种Saccharobesus litoralis的染色体存在共线性区域，而两个单复制子物种P. rhizosphaerae和P. aliena的染色体与相邻物种的染色粒有强共线性，与相邻物种的染色体几乎无共线性。基于这些结果，推测基因流或重组事件频繁发生在染色体和染色粒之间，构建了Pseudoalteromonas物种的进化模型。
3. 野生型突变积累系的自发突变率和突变谱：在P. sp. LC0214 WT MA 系中，检测到 205 个 BPS，染色体和染色粒的平均 BPS 突变率分别为 3.43×10^?10和 2.15×10^?10，染色粒的 BPS 突变率显著低于染色体；检测到 41 个 indel，染色体和染色粒的平均 indel 突变率无显著差异。突变谱分析显示，染色体的主要突变类型为转换突变和 G:C→C:G 颠换突变，染色粒以转换突变为主。

在P. sp. JCM12884^T WT MA 系中，检测到 1147 个 BPS，染色体和染色粒的平均 BPS 突变率分别为 1.61×10^?9和 1.81×10^?9，二者无显著差异；检测到 54 个 indel，染色体和染色粒的平均 indel 突变率也无显著差异。突变谱分析表明，染色体和染色粒的主要突变类型为 G:C→A:T 转换突变和 G:C→T:A、G:C→C:G 颠换突变。

整体上，两个野生型菌株的 BPS 突变率相差近 5 倍，可能是由于它们所处的不同生境带来的进化压力不同。在物种内部，P. sp. JCM12884^T的染色体和染色粒在突变率和突变谱上无显著差异，而P. sp. LC0214 的染色体突变率比染色粒高 1.5 倍，且二者突变谱存在差异，但由于P. sp. LC0214 野生型 MA 系中染色粒积累的 BPS 数量有限，可能存在统计偏差。
4. ΔmutS突变积累系的自发突变率和突变谱：在P. sp. LC0214 ΔmutS MA 系中，检测到 29738 个 BPS，染色体和染色粒的平均 BPS 突变率分别为 6.96×10^?8和 6.82×10^?8，无显著差异；检测到 942 个 indel，染色体和染色粒的平均 indel 突变率分别为 2.18×10^?9和 2.30×10^?9，也无显著差异。突变谱分析显示，染色体和染色粒的主要突变类型均为转换突变。

在P. sp. JCM12884^T ΔmutS MA 系中，检测到 16787 个 BPS，染色体和染色粒的平均 BPS 突变率分别为 3.07×10^?8和 2.95×10^?8，无显著差异；检测到 401 个 indel，染色体和染色粒的平均 indel 突变率分别为 6.69×10^?10和 8.32×10^?10，同样无显著差异。突变谱分析表明，染色体和染色粒的主要突变类型均为转换突变。

在两个 ΔmutS MA 系中，染色体和染色粒在 BPS/indel 突变率和突变谱上均无显著差异，且 MMR 功能障碍导致基因组突变率呈指数增加，表明 MMR 对复制后错配的修复效率极高。
5. ΔmutS突变积累系的 BPS 上下文依赖率和波动变化：在P. sp. LC0214 和P. sp. JCM12884^T ΔmutS MA 系中，侧翼为 G/C 的核苷酸的上下文依赖突变率较高。P. sp. LC0214 ΔmutS MA 系中，染色体和染色粒的 64 个三联体的 BPS 上下文依赖率存在差异，而P. sp. JCM12884^T ΔmutS MA 系中二者相似。

进一步分析发现，P. sp. JCM12884^T ΔmutS MA 系中，染色体和染色粒的前导链和后随链的 64 个三联体的 BPS 上下文依赖率相似；而在P. sp. LC0214 ΔmutS MA 系中，二者差异较大，尤其是 5′-N [A/C] N-3′三联体。这可能是由于单向复制染色粒的后随链在复制过程中以单链形式暴露的时间更长，导致特定突变。

此外，染色体的 BPS 突变率沿染色体呈对称波状分布，在复制起点附近较低，在中间和末端区域较高；P. sp. LC0214 ΔmutS MA 系的染色粒中，BPS 突变率在复制起点（或终点）较高，无对称波状分布，P. sp. JCM12884^T ΔmutS MA 系的染色粒虽在复制起点附近 BPS 突变率较高，但仍呈现对称波状分布。推测这种差异与染色粒的复制方向有关，双向复制染色粒的突变特征比单向复制染色粒更接近染色体。

讨论

本研究通过比较基因组学和 MA-WGS 策略，对Pseudoalteromonas属中染色体和染色粒的序列组成和自发突变特征进行了研究。发现染色体和染色粒在序列三核苷酸频率、GC 含量、单拷贝同源基因的 Ka/Ks 值等方面存在相似性，基因共线性分析揭示了染色粒之间的关系以及与单复制子物种的联系。

MA-WGS 分析表明，MMR 缺陷菌株中染色体和染色粒的突变率和突变谱高度相似，但在 BPS 上下文依赖突变率和突变变化模式上存在差异。P. sp. LC0214 和P. sp. JCM12884^T由于生活环境不同，在突变率和突变谱上存在差异，这是它们在不同进化压力下的结果。

在多复制子细菌中，染色粒的形成有分裂假说和质粒假说，但目前对多复制子细菌进化模式的系统研究较少。本研究构建的系统发育树显示了不同属物种的分布情况，表明不能简单概括染色粒的起源和形成模式。

此前研究认为次级复制子与物种基因组大小扩张有关，但在Pseudoalteromonas属中，染色体和染色粒的大小关系以及单复制子物种的情况较为复杂。推测基因流或重组事件促进了染色体和染色粒之间的相似性，且染色粒可能由染色体片段与细胞内质粒融合进化而来，但这一假说需要进一步实验验证。

此外，研究发现双向复制染色粒与染色体的进化关系更密切，单向复制染色粒可能有向双向复制进化的趋势，染色粒突变率变化模式的差异可能与复制方向和质粒复制模式有关，不过仍需深入研究验证。

本研究丰富了对多复制子细菌基因组组成特征和进化模式的认识，为深入研究细菌次级复制子的起源和进化提供了新的方向和基础。