高致病性禽腺病毒 4 型（FAdV-4）致肾损伤机制新探：自噬与病毒传播的隐秘关联

《Microbiology Spectrum 3.7》：Mechanistic insights into the kidney injury in chickens induced by hypervirulent fowl adenovirus serotype 4

这篇研究聚焦高致病性禽腺病毒 4 型（FAdV-4），其自 2015 年肆虐全球家禽业。研究通过体内外实验，揭示 FAdV-4 感染鸡肾组织的损伤机制，发现自噬样囊泡介导病毒传播且自噬促进病毒复制，为防控 FAdV-4 提供关键依据。

　　

高致病性禽腺病毒 4 型（FAdV-4）研究背景

高致病性禽腺病毒 4 型（FAdV-4），1987 年在巴基斯坦安卡拉首次被发现，也被称为 “安卡拉病” 。自 2015 年起，它在全球广泛传播，日本、中国、美国、韩国、加拿大等多个国家都有感染记录。FAdV-4 属于禽腺病毒属，是一种无包膜、二十面体、双链 DNA 病毒，能感染鸡、鸭、鹅、孔雀等禽类。根据毒力不同，可分为致病性和非致病性菌株。2015 年后，中国出现的新型致病性 FAdV-4 毒株，具有心包积水综合征，传播迅速，能在肝脏、肾脏、脾脏、肺等多组织中复制，引发肝炎 - 心包积水综合征、肾炎等疾病，死亡率高达 30% - 100%，给家禽业带来巨大经济损失。

此前，对 FAdV-4 的研究主要集中在致病性、先天免疫和疫苗方面。虽然已明确其感染会导致肝脏损伤，是由于感染后 LXR-α 信号通路激活，致使肝细胞内甘油三酯积累，引发肝脂肪变性，但 FAdV-4 感染导致肾损伤的分子机制仍不明确。

细胞自噬是一个高度保守的分解代谢过程，在这个过程中，双层膜囊泡会包裹并隔离病原体、异常蛋白质和细胞器，然后在溶酶体中进行降解，以此维持细胞内环境的稳定。多种应激刺激，如内质网（ER）应激、饥饿、氧化应激和病毒感染等，都能诱导细胞自噬。在病毒进化过程中，细胞自噬就像一把双刃剑，不同的病毒会采用不同策略，利用自噬来促进或限制自身的复制。比如，蛋下降综合征病毒可通过 PI3K/AKT/MTOR 途径激活鸭胚成纤维细胞的自噬，从而促进自身复制；而禽双 RNA 病毒的 VP2 蛋白与受体结合触发的自噬，则会抑制病毒复制。虽然已有研究表明自噬在 FAdV-4 感染中起作用，如病毒六邻体蛋白与宿主 BAG3 相互作用诱导细胞自噬，促进在 LMH 细胞中的病毒复制，但高致病性 FAdV-4 诱导细胞自噬的精确分子机制仍不清楚。而且，自噬与肾损伤之间存在关联，不过自噬如何影响肾损伤中的细胞死亡模式，以及在动态平衡过程中发生了哪些分子相互作用，这些问题都有待研究。

材料与方法

研究中使用的 FAdV-4 毒株（GenBank ID：MG856954.1）分离自中国广东省梅州市，由福建省农业科学院福建省禽病防控重点实验室保存。实验所用的 SPF 鸡和 SPF 鸡胚购自济南斯帕法斯家禽有限公司。

在对感染后原代鸡肾细胞进行超微结构分析时，先从 18 日龄的 SPF 鸡胚中无菌取出肾脏，用杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）冲洗 3 次，然后切成小块，用 0.25% 的胰蛋白酶消化 5 个循环，每次 2 分钟。将细胞悬液在 1200×g的条件下离心 3 分钟，得到细胞沉淀，加入含有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 / 链霉素的 DMEM 培养基重悬细胞，调整细胞密度至 1×10⁶/mL，在 CO₂培养箱中培养。当原代鸡肾细胞培养约 24 小时形成新鲜单层后，接种 2 个半数组织培养感染剂量（2 TCID₅₀）的 FAdV-4 病毒悬液。在感染后 48 小时，通过显微镜观察细胞病变效应。为研究 FAdV-4 在原代鸡肾细胞中的复制动态变化，在感染后的 12、24、48、72、96 和 120 小时收集病毒悬液，采用 qPCR 方法测定病毒载量。同时，对感染细胞和正常对照细胞进行处理，制备超薄切片，在电子显微镜下观察细胞超微结构，自噬样囊泡被定义为直径在 0.3 - 2.0μm 的双膜或单膜囊泡。

进行肾脏感染后组织病理学分析时，将 35 日龄的 SPF 鸡分为两组，一组肌肉注射 0.5×10^3.8 TCID₅₀/mL 的 FAdV-4 悬液，每只鸡注射 0.2mL；对照组注射 0.2mL PBS。在病毒攻毒 24 小时后，收集肾脏组织样本，用 4% 多聚甲醛固定 24 小时，然后制成石蜡切片，进行苏木精 - 伊红（HE）染色，观察 FAdV-4 感染后肾脏组织的早期病理损伤。

免疫组化实验中，对病毒攻毒 24 小时后的感染鸡肾脏组织和正常肾脏组织制备石蜡切片，脱蜡后进行抗原修复，用 4% 牛血清白蛋白（BSA）处理 45 分钟，加入兔抗 Fiber-2 多克隆抗体（稀释 1:500）孵育过夜，再加入山羊抗兔辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（稀释 1:10000），在 37°C 孵育 45 分钟。经过多次 PBS 洗涤后，用 3,3'- 二氨基联苯胺染色，再用苏木精复染 10 分钟，最后脱水、透明、封片，在显微镜下比较 FAdV-4 感染前后的组织病理学变化，棕色 - 黄色染色表示 FAdV-4 感染后 Fiber2 蛋白的阳性信号。

免疫荧光实验旨在研究 FAdV-4 感染后肾脏组织中自噬与病毒复制的关系，检测病毒 Fiber2 蛋白与宿主自噬相关蛋白 LC3B 和外泌体特异性标记蛋白 CD63 的共定位情况。收集感染 FAdV-4 24 小时的 SPF 鸡肾脏组织，切成 3×3×3mm³的切片，固定、制成石蜡切片。经过抗原修复后，用 2% BSA 封闭 120 分钟，依次加入兔抗 FAdV-4 的 Fiber2 抗体、兔抗 LC3B 多克隆抗体和兔抗 CD63 多克隆抗体，孵育 60 分钟，再加入山羊抗兔 Alexa Fluor 488 或花青 3（Cy3）标记的二抗，孵育 60 分钟，用 4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚（DAPI）染细胞核 10 分钟，封片后用共聚焦免疫荧光显微镜观察阳性荧光信号。

定量实时 PCR 用于评估炎症因子（IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8 和 TNF-α）和抗病毒细胞因子（IFN-α、IFN-γ、MX-1 和 OASL）的表达水平，以研究 FAdV-4 感染鸡肾脏中的先天免疫反应。在感染后的 6、12 和 24 小时，从每组 3 只鸡中获取 50mg 肾脏组织，放入 500μL Trizol 试剂中，液氮速冻。提取总 RNA 并反转录成 cDNA，采用特定的反应方案和引物进行 RT-qPCR，利用 2^-ΔΔCt方法计算炎症因子和抗病毒细胞因子的相对 mRNA 表达水平，使用 GraphPad Prism 8 软件进行数据分析。

蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析用于检测感染 FAdV-4 的 SPF 鸡肾脏中自噬相关因子 LC3B、SQSTM1、BECN1、ATG5 和 GRP78 的表达水平。取 100mg 肾脏组织样本匀浆，加入含 1mM PMSF 的 RIPA 裂解液，冰上裂解 10 分钟，12000×g、4°C 离心 10 分钟，收集上清液并调整蛋白浓度至 2mg/mL，每孔上样 10μL。进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用 5% 脱脂牛奶封闭 2 小时，加入稀释 1:1000 的一抗孵育过夜，洗涤后加入稀释 1:10000 的 HRP 标记二抗，振荡孵育 2 小时，再次洗涤后用增强化学发光试剂盒显色，用凝胶成像系统捕获蛋白条带，并用 ImageJ 软件进行定量分析。

为探究细胞自噬调节剂对 FAdV-4 复制的影响，首先用 Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒检测自噬调节剂雷帕霉素和 3 - 甲基腺嘌呤（3-MA）对原代鸡肾细胞活力的影响。将原代鸡肾细胞稀释至 1×10⁵ cells/mL，培养成新鲜单层后，用不同浓度的雷帕霉素（5、10、25 和 50nM）或 3-MA（1、2、3 和 4mM）处理 48 小时，通过 CCK-8 检测细胞活力，确定合适的自噬调节剂浓度。然后，在原代鸡肾细胞培养至新鲜单层后，加入优化浓度的雷帕霉素或 3-MA 处理 4 小时，再接种 2 TCID₅₀的 FAdV-4，继续培养 2 小时，更换为含 2% 胎牛血清的 DMEM 维持培养，在 24 和 48 小时收集样本，通过 Western blotting 检测相关蛋白的表达水平。

所有实验数据均采用 GraphPad Prism 8.0.2 软件进行双向方差分析（ANOVA），数据以三次独立实验的平均值 ± 标准差表示，P > 0.05 表示无显著性差异，P < 0.05 表示有显著性差异，P < 0.01 表示差异显著，P < 0.001 表示差异极显著。

实验结果

在对感染 FAdV-4 的肾细胞进行超微结构分析时发现，感染 48 小时后，原代鸡肾细胞出现典型的细胞病变效应，细胞体积增大并形成团块。通过 qPCR 检测发现，病毒载量在 24 和 48 小时显著增加，表明 FAdV-4 处于对数生长期。在 48 小时的细胞超微结构中，观察到病毒粒子在细胞核内聚集，形成明显的病毒装配工厂，病毒粒子大小约 70nm，呈结晶状排列。与正常细胞相比，感染后细胞核膜破裂并逐渐解体，内质网扩张且形态异常，细胞质中出现大量空泡，核膜不连续，子代病毒从受损的细胞核通过细胞膜释放出来。此外，细胞质中的线粒体也发生变形、肿胀，嵴结构紊乱，部分线粒体甚至消失或形成空泡，还在一些线粒体中观察到病毒粒子，这表明病毒感染可能导致线粒体损伤。同时，在细胞质中观察到自噬样囊泡，这些囊泡似乎包裹着受损的细胞器、细胞碎片或病毒粒子，说明感染后细胞自噬被激活。而且，这些囊泡在肾细胞质和细胞外空间都有出现，并且运输了大量病毒粒子，这可能是高致病性 FAdV-4 感染和传播的一种潜在机制。

肾脏感染后的组织病理学分析结果显示，正常肾脏的肾小管上皮细胞和毛细血管结构完整，肾小管腔中无渗出物。但在感染 24 小时后，肾小管上皮细胞出现变性、坏死和肿胀，肾小管腔中可见大量红细胞和脱落的上皮细胞，肾上皮细胞的细胞质中出现圆形空泡，部分细胞核移位或发生核溶解。肾小球也出现扩张和变性，肾小囊间隙增大。免疫组化分析表明，FAdV-4 感染后，肾脏间质、上皮细胞和部分肾小球细胞出现棕黄色染色，说明 FAdV-4 主要靶向这些肾脏细胞，肾脏结构的损伤和瘢痕形成可能意味着肾脏功能出现障碍。

对感染后肾脏中细胞因子 mRNA 水平的分析发现，在感染后的 6、12 和 24 小时，炎症因子 IL-1β 和 IL-2 的 mRNA 水平相对较低，而 IL-6、IL-8 和 TNF-α 的 mRNA 水平在 24 小时显著上调，分别增加了 2.7 倍、2.7 倍和 2.0 倍。IFN-α 的 mRNA 表达水平在病毒感染早期（6、12 和 24 小时）显著下调，IFN-γ 的表达水平在 6 小时下调，24 小时则显著上调 10.0 倍。此外，MX-1 和 OASL 的 mRNA 表达水平在 24 小时分别显著上调 54.0 倍和 41.7 倍。这些结果表明，FAdV-4 感染 24 小时后，能显著上调炎症细胞因子 IL-6、IL-8、TNF-α 以及抗病毒细胞因子 IFN-γ、MX-1 和 OASL 的表达，其中 IFN 刺激的细胞因子 MX-1 和 OASL 的上调引发了强烈的抗病毒先天免疫反应。

研究 FAdV-4 感染对 SPF 鸡肾细胞自噬的影响时，通过 Western blotting 分析发现，FAdV-4 感染的肾脏组织中，自噬关键标记物 LC3-II 的表达上调了 2.7 倍，ATG5 和 BECN1 的表达分别上调 3.1 倍和 3.3 倍，而 SQSTM1 的表达则下降了 2.6 倍，这表明 FAdV-4 感染诱导了肾脏细胞的完全自噬。有趣的是，GRP78 的表达在感染后增加了 2.3 倍，这暗示着内质网应激介导的自噬与体内病毒复制之间可能存在联系。

利用 CCK-8 检测细胞自噬调节剂对原代鸡肾细胞活力的影响，结果表明随着自噬调节剂浓度的增加，细胞活力逐渐下降。当雷帕霉素浓度在 5 - 25nM 时，细胞活力保持在 90% 以上，但浓度达到 50nM 时，细胞活力降至 86.03%；3-MA 浓度为 1mM 和 2mM 时，细胞活力分别为 98.82% 和 95.49%，浓度增加到 3mM 时，细胞活力降至 85.67%。综合考虑，雷帕霉素和 3-MA 的最佳浓度分别为 10nM 和 1mM，此时对原代肾细胞活力的影响最小。进一步研究细胞自噬对 FAdV-4 增殖的影响，结果显示在不添加自噬调节剂的情况下，FAdV-4 感染后自噬增强，Fiber2 蛋白表达增加。在雷帕霉素处理组，Fiber2 蛋白表达升高；而在 3-MA 处理组，Fiber2 蛋白表达受到抑制。雷帕霉素处理的细胞在 24 小时时，LC3B、Beclin1、ATG5 和 GPR78 的表达分别上调 2.20 倍、1.63 倍、1.38 倍和 1.60 倍，SQSTM1 表达下降 2.24 倍；48 小时时，这些蛋白的表达分别上调 2.85 倍、2.69 倍、2.81 倍和 2.79 倍，SQSTM1 表达下降 2.47 倍。相反，3-MA 处理组在 24 小时时，LC3B、Beclin1、ATG5 和 GPR78 的表达分别下调 2.20 倍、1.92 倍、2.27 倍和 2.12 倍，SQSTM1 表达增加 1.66 倍；48 小时时，这些蛋白的表达分别下调 5.25 倍、3.31 倍、3.14 倍和 3.18 倍，SQSTM1 表达增加 1.73 倍。

为研究自噬与病毒复制的相关性，通过免疫荧光实验检测病毒蛋白 Fiber2 和自噬标记物 LC3B 在感染 FAdV-4 的肾脏组织细胞中的亚细胞定位。结果发现在感染的肾细胞中，出现了指示细胞自噬形成的 LC3B 聚集荧光信号，并且 LC3B 和 Fiber2 蛋白共定位，这表明 FAdV-4 诱导的细胞自噬能够增强病毒在肾细胞中的复制。同时，检测外泌体特异性标记蛋白 CD63 的分布，发现 FAdV-4 感染的肾细胞中 CD63 和 Fiber2 共定位，这暗示自噬样囊泡在 FAdV-4 的复制过程中可能发挥作用。

讨论

细胞自噬是一个动态的细胞过程，通过自噬 - 溶酶体途径降解细胞质中受损或异常的蛋白质以及衰老的细胞器。在这个过程中，单膜或双膜囊泡的形成有助于溶酶体对受损细胞器和细胞碎片的降解，维持细胞内环境的稳定。自噬作为机体对抗病毒的天然防御机制，是先天免疫反应的重要组成部分。然而，某些病毒为了自身的复制，会通过特定的病毒蛋白来操控细胞自噬。已有体外研究表明，细胞自噬在宿主细胞对 FAdV-4 感染的反应中起着重要作用。正常肾细胞中基础自噬水平较低，这体现了基础自噬对维持宿主细胞内环境稳定的重要性。当受到 FAdV-4 感染后，肾脏组织中的自噬相关标记蛋白 LC3B、ATG5 和 BECN1 表达上调，同时 p62/SQSTM1 发生降解。LC3B 和 ATG5 在自噬体的形成和自噬途径的调控中至关重要，LC3B 还参与囊泡的膜扩张和闭合过程；ATG5 则促进囊泡的形成和成熟；BECN1 调节自噬的早期阶段，也与囊泡的形成有关。本研究结果表明，FAdV<