猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染仔猪线粒体损伤机制新发现：miR-34c/COX1 轴的关键作用

《Journal of Virology 4.0》：Induction of mitochondrial damage via the CREB3L1/miR-34c/COX1 axis by porcine epidemic diarrhea virus infection facilitates pathogenicity

这篇研究聚焦猪流行性腹泻病毒（PEDV），发现其感染激活 miR-34c/COX1 轴，导致仔猪小肠上皮细胞线粒体功能障碍和自噬。该研究为 PEDV 致病机制提供新视角，有望为防控该病毒引发的疾病提供潜在靶点。

　　

猪流行性腹泻病毒（PEDV）研究背景

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一种在猪群中传播的肠道病原体，主要通过粪口途径传播 。它能感染新生仔猪，引发急性病毒性肠道感染，导致腹泻和死亡，给全球养猪业带来巨大经济损失。小肠上皮细胞是 PEDV 的主要靶细胞，病毒在这些细胞内增殖，会破坏小肠绒毛的正常功能，引发严重腹泻或呕吐。

线粒体在小肠上皮细胞的营养吸收和屏障功能中起着重要作用，它参与细胞内的信号转导、ATP 合成、先天免疫反应、自噬和凋亡等过程。已有研究表明，线粒体损伤在某些肠道病毒疾病的发病机制中至关重要，如轮状病毒感染可诱导线粒体功能障碍，进而引发细胞凋亡和腹泻 。miRNA（一类非编码 RNA 分子）可以调节基因表达，部分 miRNA 存在于线粒体中，被称为线粒体 miRNA（mitomiR），它们能调节线粒体相关基因的表达，影响线粒体的形态、代谢、氧化还原稳态、自噬和凋亡，但在病毒感染细胞中，mitomiR 介导的线粒体损伤的病理机制尚不清楚。

基于此，本研究提出假设：PEDV 感染会导致线粒体功能障碍，且这一过程由特定的 miRNA 靶向线粒体基因介导。研究旨在探究 PEDV 感染对仔猪小肠上皮细胞线粒体功能的影响，以及相关 miRNA 的调控机制。

PEDV 感染导致体内空肠上皮细胞肠道损伤和线粒体紊乱

研究人员利用新生仔猪建立了 PEDV 体内感染空肠上皮细胞的模型。结果显示，感染组仔猪空肠绒毛萎缩、缩短，上皮细胞有脱落现象。TUNEL 染色表明，感染组空肠上皮细胞的凋亡损伤程度更高。透射电镜观察发现，感染组空肠上皮细胞线粒体形态紊乱，嵴消失，还出现了明显的自噬体，而对照组未出现这些变化。

进一步检测发现，感染组空肠上皮细胞线粒体复合物 III、IV 和 V 的活性显著降低，ATP 生成相应减少。用 JC-1 探针分析线粒体膜电位，发现感染组细胞绿色荧光比例增加，表明线粒体膜电位下降。MitoSOX Red 荧光成像结果显示，感染组细胞红色荧光强度显著增加，说明线粒体活性氧（mtROS）生成增多。这些结果都表明 PEDV 感染诱导了仔猪空肠上皮细胞的线粒体功能障碍。

此外，研究还发现 PEDV 感染激活了 PINK1-Parkin 通路，引发了细胞自噬。感染组中 Parkin、PINK1 和 LC3-II 蛋白表达上调，p62 蛋白表达下调，并且在空肠上皮细胞中观察到自噬结构的形成，为 PEDV 感染诱导自噬提供了证据。

线粒体 miRNA 和 mRNA 表达谱的联合表征与分析

为了确定参与 PEDV 感染过程中线粒体功能障碍和肠道损伤的潜在 mitomiR，研究人员对分离纯化的空肠上皮细胞线粒体进行了小 RNA 测序。通过透射电镜和蛋白质免疫印迹实验确认了线粒体的结构完整性和纯度。测序结果显示，有 9 种 mitomiR 上调，29 种 mitomiR 下调，其中 miR-34c 上调最为显著，ssc-miR-451_R-1 下调最为明显。定量实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）验证了 7 种差异表达的 mitomiR，结果与测序数据趋势一致，证实了测序分析的可靠性。

考虑到 miRNA 对基因表达的调控作用，研究人员用 qRT-PCR 检测了 PEDV 感染期间空肠上皮细胞线粒体基因组中 13 种蛋白质编码基因的表达水平。结果发现，ND3、ND6 和 ND5 基因显著上调，而 COX1、CYTB 和 ATP6 基因显著下调 。通过 miRanda 软件预测差异表达的 mitomiR 与线粒体基因组蛋白质编码基因的靶向关系，并用 STRING v11.0 和 Cytoscape v3.8.0 软件分析和构建相互作用网络，发现 miR-34c 可能靶向 COX1，且 miR-34c 表达的显著上调与 COX1 表达的下调密切相关，提示 PEDV 感染可能通过 miR-34c 调节 COX1 的表达。

miR-34c 直接靶向 COX1 并调节其在 PEDV 感染的 IPEC-J2 细胞中的表达

为了深入研究 mitomiR 在 PEDV 感染中的调控机制，研究人员建立了 PEDV 体外感染 IPEC-J2 细胞的模型。实验数据表明，PEDV 能有效感染 IPEC-J2 细胞，且感染 48 小时后的感染效果明显优于 24 小时。qRT-PCR 检测发现，随着 PEDV 感染时间的延长，线粒体中 miR-34c 的表达显著上调。荧光原位杂交（FISH）染色显示，感染 24 和 48 小时后，miR-34c 的荧光信号明显增强，且与线粒体有很强的共定位，说明 PEDV 感染诱导了 miR-34c 的表达和向线粒体的转运。

研究人员发现 miR-34c 与 COX1 之间存在潜在的结合位点，通过构建含有野生型或突变型 COX1 的荧光素酶报告基因载体进行荧光素酶报告实验。结果显示，过表达或敲低 miR-34c 对 COX1 突变体的荧光素酶活性没有明显影响，但过表达 miR-34c 抑制了含有野生型 COX1 的荧光素酶报告基因的翻译，敲低 miR-34c 则有相反的效果，表明 miR-34c 直接与 COX1 结合。

进一步检测 IPEC-J2 细胞中 COX1 蛋白的表达，发现转染 miR-34c 模拟物抑制了 COX1 的表达，而转染 miR-34c 抑制剂则促进了 COX1 的表达。在 PEDV 感染的细胞中，COX1 蛋白表达显著下调，过表达 miR-34c 进一步增强了这种抑制作用，敲低 miR-34c 则逆转了这种抑制效果，说明 PEDV 感染通过诱导 miR-34c 的上调来下调 COX1 蛋白的表达。

PEDV 感染在体外诱导 IPEC-J2 细胞线粒体功能障碍和自噬

研究人员检测了 PEDV 感染对 IPEC-J2 细胞线粒体功能和自噬的影响。随着 PEDV 感染时间的延长，线粒体复合物 III - V 的活性和 ATP 生成显著下降，尤其是在感染 24 和 48 小时后。线粒体氧消耗率也明显降低，包括基础呼吸、ATP 相关呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力的氧消耗率。同时，线粒体膜电位下降，mtROS 水平显著升高。

通过共转染 GFP-LC3、LysoTracker 和 MitoTracker 评估自噬活性，发现感染 24 和 48 小时后，GFP-LC3 和 LysoTracker 与 MitoTracker 的共定位显著增强。此外，自噬相关蛋白 Parkin、PINK1 和 LC3-II 的表达随时间显著上调，p62 表达下调。这些结果证实了 PEDV 感染体外诱导了 IPEC-J2 细胞的线粒体功能障碍和自噬。

PEDV 感染通过 miR-34c/COX1 轴调节线粒体功能障碍和自噬

研究发现 PEDV 感染的 IPEC-J2 细胞中 COX1 显著下调，为了进一步探究 miR-34c/COX1 通路在调节线粒体功能和自噬中的作用，研究人员分别将 pCAGGS-COX1 和 si-COX1 与 miR-34c 抑制剂共转染到 IPEC-J2 细胞中，成功建立了 miR-34c/COX1 的抑制和过表达模型。

实验结果表明，miR-34c 抑制剂有效缓解了 PEDV 感染诱导的线粒体功能障碍和自噬，过表达 COX1 显著增强了 ATP 生成、线粒体复合物 III - V 的活性、不同阶段的线粒体氧消耗和线粒体膜电位，同时降低了 mtROS 水平。转染 si-COX1 则显著减弱了 ATP 生成、线粒体复合物 III - V 的活性、线粒体氧消耗和线粒体膜电位，增加了 mtROS 水平。激光共聚焦显微镜荧光图像显示，COX1 过表达显著降低了 PEDV + miR-34c 抑制剂处理组中 GFP-LC3 和 LysoTracker 与 MitoTracker 的共定位率，敲低 COX1 则有相反的效果。此外，与 PEDV + miR-34c 抑制剂处理组相比，添加 pCAGGS-COX1 的 PEDV + miR-34c 抑制剂 + pCAGGS-COX1 处理组中 Parkin、PINK1 和 LC3-II 蛋白表达显著减弱，p62 蛋白表达升高；而 PEDV + miR-34c 抑制剂 + si-COX1 处理组则呈现相反的结果。这些结果表明，miR-34c/COX1 轴介导了 PEDV 感染期间的线粒体功能障碍和自噬。

CREB3L1 在 PEDV 感染期间结合 miR-34c 启动子激活 miR-34c/COX1 轴

研究人员探究了 PEDV 感染期间 miR-34c 上调的上游调控机制。通过 JASPAR 和 CIS-BP 数据库预测与 miR-34c 启动子上游区域结合的潜在转录因子，并结合数据分析，确定了 CREB3L1、ZNF704 和 HES2 这三个潜在的转录调节因子。qRT-PCR 分析证实，PEDV 感染上调了 IPEC-J2 和 LLC-PK 细胞中 CREB3L1、ZNF704 和 HES2 的表达，同时也增加了 LLC-PK 细胞中线粒体 miR-34c 的表达。

在细胞系中过表达或敲低 CREB3L1、ZNF704 和 HES2，发现只有 CREB3L1 调节 miR-34c 的表达水平。在 miR-34c 启动子的 - 654 至 - 641bp 区域鉴定出 CREB3L1 的结合基序。构建含有野生型或突变型 miR-34c 启动子序列的荧光素酶报告质粒进行荧光素酶报告实验，结果显示 CREB3L1 激活了野生型 miR-34c 启动子，但对突变型启动子没有影响。染色质免疫沉淀实验进一步证实了 CREB3L1 直接结合到 miR-34c 启动子上。

在 PEDV 感染的 IPEC-J2 和 LLC-PK 细胞中过表达 CREB3L1，显著增强了 miR-34c 的表达，降低了 COX1 的表达；敲低 CREB3L1 则导致 miR-34c 表达下降，COX1 表达增加。此外，在敲低 CREB3L1 的 PEDV 感染细胞中转染 miR-34c 模拟物降低了 COX1 的表达，转染 miR-34c 抑制剂则增加了 COX1 的表达。这些结果表明，PEDV 感染通过上调 CREB3L1 来调节 miR-34c/COX1 通路。

PEDV 诱导的 CREB3L1 通过调节 miR-34c/COX1 轴促进线粒体功能障碍和自噬

为了确定 CREB3L1 是否通过激活 miR-34c/COX1 轴调节 PEDV 感染期间的线粒体功能和自噬，研究人员将 si-CREB3L1、miR-34c 模拟物和 miR-34c 抑制剂单独或组合转染到 IPEC-J2 细胞中。结果发现，si-CREB3L1 减轻了 PEDV 感染诱导的线粒体功能障碍和自噬。

转染 miR-34c 模拟物显著降低了线粒体复合物 III、IV 和 V 的活性、ATP 生成、线粒体氧消耗和线粒体膜电位，同时增加了 mtROS 水平；转染 miR-34c 抑制剂则有相反的效果。此外，转染 miR-34c 模拟物显著增强了 PEDV + si-CREB3L1 处理组中 GFP-LC3、LysoTracker 和 MitoTracker 的共定位率，miR-34c 抑制剂则降低了共定位率。在蛋白表达方面，miR-34c 模拟物恢复了 si-CREB3L1 诱导的 Parkin、PINK1 和 LC3-II 蛋白表达的下降，降低了 p62 蛋白表达；miR-34c 抑制剂则呈现相反的结果。这些结果证实，PEDV 感染上调的 CREB3L1 通过 miR-34c/COX1 轴调节线粒体功能障碍和自噬。

研究讨论

PEDV 感染仔猪会导致小肠绒毛萎缩、脱落，引发严重的水样腹泻和萎缩性肠炎。本研究通过体内外实验发现，线粒体功能障碍在 PEDV 感染小肠上皮细胞的病理过程中起着关键作用，包括线粒体形态改变、线粒体复合物 III - V 活性降低、ATP 生成减少、线粒体氧消耗下降、线粒体膜电位降低以及 mtROS 积累等。同时，PEDV 感染还诱导了自噬，感染后 24 和 48 小时，IPEC-J2 细胞中观察到线粒体与 GFP-LC3、线粒体与溶酶体的共定位增强。

肠道上皮细胞的病理改变在 PEDV 感染的发病机制中至关重要，线粒体在肠道上皮细胞中数量丰富，其功能对维持肠道正常生理功能意义重大。许多病原体感染会破坏线粒体的结构和功能，影响肠道屏障完整性和免疫功能，如大肠杆菌感染可导致 T84 上皮细胞线粒体肿胀、膜电位去极化和 ATP 水平降低；呼吸道合胞病毒感染会使宿主细胞线粒体形态改变、呼吸功能受损和 ROS 积累；乙肝病毒感染通过其 X 蛋白与线粒体相关蛋白结合，导致线粒体损伤 ；新冠病毒感染可诱导宿主支气管上皮细胞线粒体裂变、氧化磷酸化受损和细胞凋亡。

miRNA 在调节细胞内基因表达方面发挥着重要作用，部分 miRNA 可以进入线粒体参与调节线粒体基因表达，影响线粒体功能和细胞过程。例如，miR-1 可促进线粒体相关蛋白合成和 ATP 生成；miR-181c 抑制 mt-COX1 蛋白表达，影响线粒体膜电位和 ROS 产生；miR-2393 调节多个线粒体基因的转录水平，影响线粒体代谢和凋亡；miR-762 和 miR-1285 分别通过靶向线粒体基因影响线粒体功能和自噬 。本研究发现，PEDV 感染诱导 miR-34c 上调并转运到线粒体中，抑制 COX1 的表达。

miR-34c 在猪的多种组织和细胞中发挥不同作用，如调节睾丸发育、干细胞增殖分化、神经元迁移和细胞多能性等。COX1 是线粒体呼吸链复合物 IV 的核心亚基，参与电子传递和质子跨膜运输，促进 ATP 合成，其功能受损会直接影响线粒体氧化磷酸化。本研究证实，PEDV 感染通过 miR-34c/COX1 轴调节空肠上皮细胞的线粒体功能障碍和自噬。

CREB3L1 是一种哺乳动物细胞中的 bZIP 转录因子，在中枢神经系统的神经内分泌过程、内分泌细胞激素分泌以及多种组织和肿瘤细胞中发挥重要的生理和病理调节作用 。本研究通过多种实验方法证明，PEDV 感染上调 CREB3L1 的表达，CREB3L1 结合到 miR-34c 启动子区域，激活 miR-34c/COX1 轴，进而调节空肠上皮细胞的线粒体损伤和自噬。此前有研究表明，CREB3L1 可以限制某些病毒的传播，但本研究进一步揭示了其在 PEDV 感染中的作用机制，不过 CREB3L1-miR-34c 轴在 PEDV 感染中的特异性还需要进一步研究。

综上所述，本研究首次探索了 PEDV 感染期间宿主细胞线粒体 miRNA 的调控模式，发现 PEDV 诱导核 miR-34c 表达并转运到线粒体中，抑制 COX1 翻译，导致线粒体功能障碍和自噬。PEDV 感染还上调转录因子 CREB3L1，激活 miR-34c/COX1 轴，调节空肠上皮细胞的线粒体损伤。这些结果为 PEDV 感染中线粒体 miRNA 调控和线粒体损伤机制提供了新的视角，提示线粒体 miRNA 可能成为对抗病毒感染的新靶点。

材料与方法

1. 动物实验：选取 10 只未感染 PRRSV、PRV 和 PEDV 的新生仔猪，随机分为两组，每组 5 只。一组用 2mL 剂量为 10^6.5组织培养感染剂量 50%（TCID₅₀）的 PEDV 攻毒，另一组给予等量正常 Vero 细胞培养上清作为阴性对照。攻毒前和攻毒后每隔 12 小时采集仔猪肛拭子，监测仔猪的临床表现。感染 3 天后，对仔猪实施安乐死并采集样本。
2. 细胞培养和病毒：IPEC-J2 细胞在含有 10% 胎牛血清（FBS，Gibco）的 DMEM 培养基中，于 5% CO₂、37℃条件下培养。PEDV 毒株从临床感染猪中分离并保存于实验室。IPEC-J2 细胞用无血清 DMEM 稀释的 PEDV（MOI = 0.01）感染 1 小时，然后更换为含有 4μg/mL 胰蛋白酶（Gibco，美国）的无血清 DMEM 继续培养，以支持 PEDV 感染。
3. 小肠上皮细胞和线粒体的分离：解剖猪的腹腔，切取约 20cm 长的空肠段，采用改良的 “酶 + 额外洗涤” 方法分离空肠上皮细胞 。利用密度梯度离心法分离空肠上皮细胞和 IPEC-J2 细胞的线粒体。
4. ** 组织病理学