人乳头瘤病毒 E7 蛋白与视网膜母细胞瘤蛋白 pRB 的神秘 “羁绊”：肿瘤发生调控新视角

《Journal of Virology 4.0》：The retinoblastoma protein contributes to maintaining the stability of HPV E7 in cervical cancer cells

这篇研究聚焦人乳头瘤病毒（HPV）相关宫颈癌。发现视网膜母细胞瘤蛋白（pRB）不仅是 HPV E7 的降解靶点，还对 E7 蛋白稳定至关重要。pRB 缺失会降低 E7 水平，抑制癌细胞增殖，为 HPV 相关癌症研究提供新思路。

　　

引言

人乳头瘤病毒（HPV）感染是全球重大健康问题，高危型 HPV（如 HPV - 16 和 HPV - 18）持续感染与多种癌症（尤其是宫颈癌）的发生紧密相关。在 HPV 诱导的致癌过程中，E7 癌蛋白起着关键作用，它通过与宿主细胞蛋白相互作用，干扰重要细胞过程。其中，HPV E7 与视网膜母细胞瘤蛋白（pRB）的相互作用尤为关键，pRB 是细胞周期进展的关键调节因子和肿瘤抑制蛋白。

研究表明，HPV 阳性宫颈癌细胞持续表达 E6 和 E7 癌蛋白，这对维持恶性肿瘤的发展和进展至关重要，抑制它们可抑制细胞生长。尽管 HPV E7 会被宿主细胞内的 Cullin - 1 泛素连接酶复合物通过 26S 蛋白酶体途径降解，但 HPV 阳性细胞中仍维持高 E7 水平，说明 E7 可通过多种机制逃避降解以保持稳定。此前研究发现，在宫颈癌细胞系中，USP11 和 E6 相关蛋白（E6AP）可依赖蛋白酶体稳定 E7，在头颈部癌中，膜相关泛素连接酶 MARCHF8 可通过降解连接酶 Cullin - 1（CUL - 1）和 UBE2L3 来稳定 E7。

pRB 在多种人类癌症的发生和进展中起关键作用，在 HPV 感染背景下，E7 通过泛素介导的途径降解 pRB，并干扰 pRB - E2F1 转录抑制复合物，破坏 pRB 抑制细胞周期进展的能力。此外，E7 还可独立于 pRB 激活 E2F1。虽然已有研究对 pRB 在 HPV 阳性宫颈癌中的失调机制有了一定了解，但关于 E7 与 pRB 相互作用的分子事件仍有许多未解之谜。同时，虽然已知 HPV E6 的底物识别有助于其稳定，但尚未有研究探讨 E7 底物是否也能稳定该病毒蛋白。本研究旨在揭示 pRB 与 E7 之间的相互作用，发现 pRB 的持续表达对 HPV E7 的稳定性至关重要，pRB 缺失导致的 E7 不稳定足以破坏其致癌潜力。

材料和方法

1. 细胞培养和试剂：非癌性人角质形成细胞（HaCaT 细胞）和表达 HPV - 16 或 - 18 E7 蛋白的 HPV 阳性细胞（SiHa、CaSki、HeLa 和 C - 4 I 细胞）购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），在添加 10% 胎牛血清（FBS）、青霉素 - 链霉素（100 U mL^?1）和谷氨酰胺（300 μg mL^?1）的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中，于 37°C、含 10% CO₂的湿润空气培养箱中培养。
2. 抗体和抑制剂：使用多种小鼠单克隆抗体，如抗 RB1（pRB）、抗 16 E7、抗 18 E7、抗 GAPDH、抗 α - 微管蛋白、抗 p84、抗 β - 半乳糖苷酶（β - Gal）等，以及辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠二抗。使用蛋白酶体抑制剂 CBZ（MG132 Z - Leu - Leu - Leu - al）和环己酰亚胺抑制蛋白质合成。
3. 质粒：使用两种携带靶向人 RB1（pRB）短发夹 RNA（shRNA）的慢病毒载体，即 pLKO - RB1 - shRNA19 和 TLCV2 - RB1，以及对照 shRNA 质粒 pLKO.1 GFP shRNA 和 pLKO.1 Scramble shRNA。还使用了 HA 标记的 pRB 表达构建体和通过定点突变产生的 pRB 突变体（HA - tagged pRB Y756F - N757A）。
4. siRNA 转染：将 CaSki、SiHa、HeLa 或 C - 4 I 细胞接种于 6 cm²培养板，培养 24 h 后，当细胞融合度达 30% - 40% 时，使用 Lipofectamine RNAiMax 将靶向 pRB、HPV - 18 E6/E7、HPV - 16 E6/E7 或非靶向 Scramble siRNA 转染细胞，终浓度为 20 μM。72 h 后收获细胞进行分析。
5. 慢病毒生产和稳定细胞系的建立：将包装质粒 psPAX2、包膜质粒 pCMV - VSV - G 和携带靶向 RB1 的 shRNA 质粒共转染至 HEK 293T 细胞，收集病毒上清液并过滤。将约 70% 融合的受体细胞（CaSki、SiHa、HeLa、C - 4 I 和 HaCaT）与慢病毒以 1:3 的比例混合，并添加 8 μg/mL 聚凝胺进行转染。感染后，除 HaCaT 细胞在 48 h 后开始筛选外，其他细胞系在 24 h 后使用 2 μg/mL 嘌呤霉素进行筛选，持续 2 周，筛选后的稳定细胞系在 1 μg/mL 嘌呤霉素中维持培养。
6. 实时定量 PCR（qRT - PCR）：按照 TRIzol 试剂协议提取慢病毒转染的 CaSki、SiHa、HeLa、C - 4 I 和 HaCaT 细胞的总 RNA，用 Nanodrop One 微量紫外 - 可见分光光度计测定 RNA 浓度和质量。使用 QuantiTect 逆转录试剂盒进行逆转录获得 cDNA，再用 PowerUp SYBR Green PCR Master Mix 进行 qPCR。以 GAPDH 为内参，使用 Livak 的 2^?△△Ct方法计算靶基因 mRNA 水平的变化倍数。
7. 蛋白质免疫印迹（Western blotting）：将细胞直接裂解于 2×SDS - PAGE 上样缓冲液中，95°C 变性 10 min，经 SDS - PAGE 分离后转移至 0.22 μm 硝酸纤维素膜。用 5% 脱脂奶粉在 TBS - T 中封闭 1 h，然后用相应的一抗和二抗孵育，最后使用 ECL Western blotting 检测试剂显色。
8. 蛋白酶体抑制实验：在瞬时实验中，将 CaSki、SiHa 和 HeLa 细胞转染相应 siRNA 72 h 后，用 20 μM CBZ 或二甲基亚砜（DMSO，作为对照）处理 6 h，然后收获细胞进行 Western blotting 分析。慢病毒转染的 SiHa 和 HeLa 细胞接种于 6 孔板，48 h 后进行相同处理和分析。
9. 环己酰亚胺追踪实验：将转染靶向 pRB、HPV - 16 E7 或对照 Scramble siRNA 的 CaSki 和 SiHa 细胞孵育 72 h 后，用 50 μg/mL 环己酰亚胺处理，在 0、20、40 或 60 min 时收获细胞进行细胞分级分离，对细胞质和细胞核组分进行 Western blotting 分析。慢病毒转染的 SiHa 细胞处理方式类似，但不进行分级分离。
10. 细胞分级分离：将转染 siRNA 72 h 后的 CaSki 和 SiHa 细胞胰酶消化、离心收集，用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，使用 NE - PER 核和细胞质提取试剂试剂盒按照说明书进行细胞质和细胞核组分的分离，然后添加 6×SDS - PAGE 上样缓冲液进行 Western blotting 分析。
11. EdU 细胞增殖实验：将慢病毒转染的 SiHa 和 HeLa 细胞接种于 6 孔板的盖玻片上过夜，用 10 μM 2X EdU 溶液处理 2 h，然后依次进行固定、通透、洗涤、与 Click - iT 反应鸡尾酒孵育、洗涤和核染色，最后使用 Zeiss LSM 880 Airyscan 显微镜观察，用 ImageJ v 1.54f 软件进行图像分析。
12. XTT 实验：将稳定表达靶向 RB1 的 shRNA 或对照 shRNA 的慢病毒转染细胞接种于 96 孔板，孵育 48 h 后，加入 50 μL XTT 标记混合物继续孵育 5 h，测定 450 nm 和 630 nm 处的吸光度，计算绝对吸光度（OD_total = OD₄₅₀ - OD₆₃₀），以对照组为参照计算细胞活力。
13. 集落形成实验：将慢病毒转染的 SiHa、CaSki、HeLa 和 HaCaT 细胞以 400 个细胞 / 板的密度接种于 6 cm²培养板，孵育 15 d，期间每 2 d 换液。用 4% 多聚甲醛固定集落，10% 吉姆萨染色，拍照并使用 CellCount 软件（ImageJ v 1.54f）计数集落数量，实验重复三次，独立进行两次。
14. pRB 恢复的细胞转染实验：将稳定表达靶向 RB1 的 shRNA 的 SiHa 和 HeLa 细胞接种于 6 孔板，24 h 后，用 1 μg 空载体、野生型 pRB 或 pRB 突变体转染，同时共转染 LacZ 以比较转染效率。48 h 后收获细胞裂解物进行 Western blotting 分析，以 β - Gal 作为上样对照。
15. 统计分析：使用 GraphPad Prism 5 软件进行统计分析，采用 Student's t 检验比较转染对照 siRNA/shRNA 和靶向 RB1 的 siRNA/shRNA 的细胞之间的功能差异。P < 0.05 认为差异具有统计学意义，所有实验至少进行三次，数据以平均值 ± 标准差表示。使用 ImageJ v 1.54f 软件测量 Western blot 条带强度，计算靶蛋白条带与相应上样对照条带的比值进行蛋白水平定量。

结果

1. pRB 敲低使宫颈癌细胞系中 HPV E7 癌蛋白不稳定：在研究 HPV - 16 E7 与 pRB 和 AP2M1 的选择性相互作用时，意外发现通过 siRNA 介导的 pRB 缺失会导致 CaSki 和 SiHa 细胞中 E7 癌蛋白水平降低，在 HeLa 和 C - 4 I 细胞中也观察到类似现象，只是程度较轻。为进一步研究 pRB 对 E7 稳定性的影响，构建了稳定表达对照 shRNA 或靶向 pRB 的 shRNA 的 SiHa、CaSki、HeLa 和 C - 4 I 细胞系。结果显示，稳定敲低 pRB 的细胞中，HPV - 16 和 HPV - 18 E7 蛋白水平均显著降低，且 CaSki 和 SiHa 细胞中降低更为明显，这可能与不同 E7 癌蛋白、pRB 和细胞降解机制成分之间的亲和力差异有关。这些结果表明，pRB 的存在对维持宫颈癌细胞系中 E7 蛋白水平很重要。
2. pRB 敲低增强 E7 癌蛋白的蛋白酶体降解：为探究 pRB 敲低导致 E7 不稳定的机制，使用蛋白酶体抑制剂 CBZ 处理瞬时转染和稳定转染的细胞。结果发现，抑制蛋白酶体功能可使转染对照和 pRB siRNA 的细胞中 E7 水平显著积累，但敲低 pRB 的细胞中积累的 E7 水平仍低于对照细胞，说明 pRB 介导的 E7 不稳定机制并非完全由增强的蛋白酶体降解引起。
3. pRB 敲低选择性下调 E7 转录：由于蛋白酶体抑制不能完全恢复 pRB 缺失细胞中的 E7 水平，检测了 pRB 缺失和未缺失的转导细胞中 E7 的 mRNA 水平。发现 SiHa 和 HeLa 细胞中 E7 mRNA 水平均显著下调，表明 pRB 敲低会干扰 E7 的转录，但尚不清楚这是直接作用还是通过其他转录因子（如 AP - 1 和 Brg - 1）的间接作用。
4. pRB 敲低显著缩短 HPV - 16 和 - 18 E7 的半衰期：通过环己酰亚胺追踪实验评估 E7 蛋白的翻译后稳定性。结果显示，在 CaSki 和 SiHa 细胞中，转染 Scramble siRNA 时，HPV - 16 E7 的半衰期在细胞质和细胞核中分别为 36 - 60 min；而转染靶向 pRB 的 siRNA 时，半衰期缩短约两倍，细胞质中为 18 - 20 min，细胞核中为 14 - 20 min。在转导的 SiHa 细胞中也得到类似结果，表明 pRB 敲低导致 E7 加速周转，且细胞质和细胞核中的 E7 均受影响，说明宫颈癌中 pRB 缺失导致 E7 水平降低主要是由于蛋白不稳定，而非转录水平下降。
5. pRB 敲低抑制细胞生长：通过 XTT 实验评估 pRB 敲低对宫颈癌细胞增殖的影响，发现敲低 pRB 显著降低了 SiHa 和 HeLa 细胞的生长。集落形成实验表明，pRB 敲低使 SiHa、CaSki 和 HeLa 细胞的集落数量和大小明显减少，但对非癌性 HaCaT 细胞无显著影响，这可能是由于 HPV 阳性细胞中 E7 水平降低。EdU 标记实验也显示，pRB 敲低的 SiHa 和 HeLa 细胞中 EdU 阳性细胞显著减少。这些结果表明，pRB 的持续表达对宫颈癌细胞的增殖和 E7 介导的细胞转化至关重要。
6. 过表达 pRB 恢复 SiHa 和 HeLa 细胞中的 E7 水平：将野生型 pRB 转染到稳定敲低 pRB 的 SiHa 和 HeLa 细胞中，发现 E7 水平显著恢复。而转染不能结合 E7 的 pRB 突变体（RB1 Y756F_N757A）则不能恢复 E7 水平，说明 pRB 对 E7 稳定性的调节部分通过直接的蛋白质 - 蛋白质相互作用介导。

讨论

E7 癌蛋白对 HPV 复制至关重要，其持续高表达有助于 HPV 相关癌症的致癌转化。以往研究表明，高危型 HPV（如 HPV - 16 和 HPV - 18 E7）通过降解肿瘤抑制蛋白 pRB 促进癌症发生，且 pRB 降解程度依赖于 E7 蛋白水平。本研究揭示了 pRB 的新调节作用，它类似于伴侣活性，有助于稳定 HPV - 16 和 - 18 E7 癌蛋白。

沉默 pRB 会导致 HPV - 16 E7 和 HPV - 18 E7 水平显著下降，且 HPV - 16 E7 的不稳定更为明显，这可能与两种 E7 蛋白与 pRB 的亲和力差异以及与细胞降解机制的相互作用不同有关。蛋白酶体保护虽能挽救部分 E7，但无法达到对照水平，进一步研究发现 pRB 缺陷细胞中 E7 mRNA 水平降低，这可能与 pRB 与 AP - 1 家族转录因子的相互作用有关，pRB 与 c - Jun 结合可刺激其转录活性，而 HPV - 16 E7 蛋白可抑制 pRB 对 c - Jun 的激活，这些相互作用可能影响 E7 mRNA 的调节。

此外，pRB 敲低显著抑制宫颈癌细胞系的增殖，这与预期不同，因为在宫颈癌中 HPV E7 已使 pRB 失活，通常认为 pRB 敲低会加剧细胞周期失控和增殖。但实际情况是，SiHa 和 HeLa 细胞的 DNA 合成、增殖和集落形成在 pRB 敲低后均下降，这可能归因于 E7 的不稳定。已有研究表明，下调 E7 癌蛋白可抑制癌细胞增殖、诱导细胞周期停滞和 anoikis。本研究结果表明，pRB 缺失导致的 E7 不稳定足以降低其克隆形成潜力，说明 pRB 的稳态水平对宫颈癌细胞的存活至关重要，其对 E7 的调节作用在治疗方面的意义有待进一步研究。

通过转染野生型 pRB 和不能结合 E7 的突变体实验，证实 pRB 与 E7 的相互作用丧失是 E7 水平降低和蛋白酶体降解增强的部分原因。总体而言，本研究为宫颈癌中 E7 - pRB 相互作用提供了新见解，表明 pRB 在转录和翻译后水平调节 E7 水平。