HSV-1 感染新发现：宿主基因组 Pol II 耗竭引发 + 1 核小体移位

《Journal of Virology 4.0》：HSV-1 infection induces a downstream shift of the +1 nucleosome

这篇研究聚焦于单纯疱疹病毒 1 型（HSV-1）感染，发现其导致宿主转录关闭的同时，会使宿主基因启动子处 + 1 核小体下游移位。该研究揭示了 HSV-1 感染影响染色质结构的新机制，为深入理解病毒感染与宿主细胞的相互作用提供关键线索。

　　

一、引言

单纯疱疹病毒 1 型（HSV-1）是一种常见的人类疱疹病毒，全球超半数人口受其潜伏感染。它不仅会引发普通唇疱疹，还可能导致免疫功能低下者患危及生命的疾病。HSV-1 基因组为 152kb 的双链 DNA，编码众多开放阅读框。

在 HSV-1 的裂解感染过程中，部分病毒立即早期（IE）基因，如 ICP0、ICP4、ICP22 和 ICP27，会劫持宿主基因表达机制。这使得 RNA 聚合酶 II（Pol II）从宿主染色质转移到病毒基因组，进而导致宿主转录普遍关闭。其中，ICP4 在招募 Pol II 至病毒复制区起关键作用，而 ICP22 抑制宿主转录延伸，vhs 蛋白作为核酸酶切割病毒和宿主 mRNA，进一步加剧了宿主转录的关闭。

此外，HSV-1 还干扰宿主转录终止，引发转录通读，延伸至下游基因，产生看似转录诱导的现象。这种转录通读不仅阻碍新转录 mRNA 的翻译，还将 Pol II 转录导向下游基因间区域，加重宿主基因中 Pol II 的耗竭。研究发现，ICP27 可诱导转录通读，即使是 ICP27 基因缺失突变体感染，也会因病毒诱导的细胞应激反应产生一定程度的转录通读。与应激诱导的转录通读不同，HSV-1 诱导的转录通读会使基因下游染色质可及性大幅增加，形成下游开放染色质区域（dOCRs）。

此前研究主要关注基因下游的染色质可及性，本文进一步探究宿主基因启动子周围染色质可及性的变化。研究表明，HSV-1 感染会使启动子处开放染色质区域向转录起始位点（TSS）下游扩展。同时，借鉴酵母中 Pol II 耗竭导致 + 1 核小体下游移位的研究，推测 HSV-1 感染时宿主基因中 Pol II 的耗竭可能引发类似现象，即 + 1 核小体移位。

二、结果

1. 转录起始位点下游染色质无核小体区域广泛扩展：研究人员重新分析已发表的 ATAC-seq 数据，涉及 Mock 感染、野生型（WT）HSV-1 感染，以及 ICP0、ICP22、ICP27 和 vhs 基因缺失突变体感染的人胎儿包皮成纤维细胞（HFF）。利用 RegCFinder 方法，以 7649 个人类基因 TSS 周围 ±3kb 的启动子区域为研究对象，识别差异 ATAC-seq 读取密度的基因组区域。结果显示，各病毒感染与 Mock 感染相比，均识别出大量差异子区域（RegC），部分具有统计学意义。通过对这些差异区域的分析，发现 HSV-1 感染时，大多数宿主基因启动子周围染色质可及性变化呈现三种主要模式：一是 TSS 处 ATAC-seq 峰向 TSS 下游区域移位和 / 或扩展；二是向 TSS 上游区域移位和 / 或扩展；三是在感染时 TSS 峰上下游染色质可及性均增加。还有部分基因表现为前两种模式的组合。
2. 启动子处大多数染色质可及性变化与 dOCR 诱导无关：为探究观察到的变化是否由 dOCRs 延伸至启动子区域引起，研究人员计算各簇中与 dOCRs 重叠的启动子窗口比例。结果发现，即使在 PAA 处理增强 dOCR 诱导的情况下，重叠比例最高的簇也不超过 20%，多数簇低于 5%，表明 dOCRs 在启动子周围染色质可及性变化中占比很小。而且，PAA 处理虽增加 dOCRs，但显著降低启动子处开放染色质的扩展，说明两者并无关联。此外，ICP0、ICP22、ICP27 或 vhs 基因敲除对启动子周围染色质可及性变化影响较小，表明这些变化并非由单个蛋白的活性决定。
3. 启动子周围可及染色质区域的扩展与转录相关：研究人员进行基序发现和功能富集分析，以探究染色质可及性变化与潜在转录因子结合的关系。结果发现，除簇 13（模式 III）因富含 snRNA 基因而在 mRNA 剪接相关 GO 术语中富集外，其他簇未发现富集的基序和显著的 GO 术语。进一步分析发现，模式 I 簇倾向于包含高比例的蛋白质编码基因，而模式 II 簇（如簇 7）显著富集反义转录本和双向启动子。通过计算双向启动子中正反义转录比例，证实模式 II 本质上是模式 I 在反义链上的体现。同时，基因表达分析表明，高表达基因和在 HSV-1 感染中转录减少更明显的中等表达基因，其启动子周围可及染色质扩展更显著，这与酵母中 Pol II 耗竭诱导 + 1 核小体下游移位、扩展启动子处可及染色质的现象相似。
4. 染色质可及性变化在 HSV-1 感染 4 - 6 小时开始显现：对 HSV-1 感染的 ATAC-seq 时间进程分析显示，感染 1 - 2 小时几乎未发现显著差异区域，4 小时时出现 1963 个显著区域，8 小时时增加到 7558 个。而且，早期（4 小时或更早）出现染色质可及性变化的基因表达水平显著高于 6 小时或更晚出现变化的基因，这进一步证实了基因表达水平与染色质可及性变化的关联。由于时间进程实验中病毒感染进展较慢，Pol II 从宿主基因的耗竭程度较低，导致染色质可及性变化不如原始 WT 与 Mock 比较实验明显。
5. ICP4 基因敲除减少，ICP22 和 ICP27 联合表达诱导可及染色质扩展：PAA 处理抑制 HSV-1 DNA 复制，限制病毒转录，减轻 Pol II 从宿主基因组的耗竭，显著降低启动子处可及染色质区域的扩展。同样，ICP4 基因敲除也减少了这种扩展，且 ICP4 结合位点在染色质可及性发生显著变化的基因启动子中更频繁出现，表明 ICP4 导致的 Pol II 从宿主基因组的耗竭有助于这种现象的发生。但在无病毒 DNA 复制时，仅 ICP4 活性不足以诱导完整的染色质可及性变化。此外，单独表达 ICP27 可引起部分基因染色质可及性变化，ICP22 和 ICP27 联合表达效果更明显，说明两者联合可诱导启动子处染色质可及性适度扩展，但单个蛋白不足以诱导全部变化。在 ΔICP27 感染中，虽然病毒 DNA 复制缺失，但由于进入细胞的病毒基因组数量较多，仍可观察到染色质变化。
6. HSV-1 感染诱导 + 1 核小体下游移位：HSV-1 感染导致启动子处染色质可及性变化，暗示核小体无核小体区域扩展，可能涉及 + 1 或 - 1 核小体位置的改变。研究人员通过对非规范组蛋白变体 H2A.Z 进行 ChIPmentation 实验，发现 HSV-1 感染时，模式 I 和模式 I + II 簇基因的 TSS 下游 H2A.Z 相对增加，上游相对减少，反映出 + 1 核小体峰下游移位和扩展，以及 + 1 核小体峰相对于 - 1 核小体峰的相对增加；而模式 II 簇（如簇 7）则呈现相反趋势。重新分析 α - amanitin 处理的 HCT116 细胞的 H2A.Z ChIP-seq 数据发现，α - amanitin 处理导致 Pol II 从基因启动子耗竭，同样引起 + 1 核小体下游移位，且模式 II 簇基因的 - 1 核小体向上游移位，进一步证实了 HSV-1 感染时 Pol II 耗竭导致 + 1 核小体移位的结论。

三、讨论

本研究揭示了 HSV-1 感染时宿主基因启动子染色质结构的显著变化。约 57% 的基因在 WT HSV-1 感染时启动子染色质可及性分布发生显著变化，主要表现为模式 I（向 TSS 下游扩展）和模式 II（向 TSS 上游扩展），还有部分基因呈现两种模式的组合。这些变化与 dOCRs 无关，且不受 ICP0、ICP22、ICP27 和 vhs 基因敲除的显著影响，但 ICP4 基因敲除和 PAA 处理可减轻变化，表明 HSV-1 诱导的 Pol II 从宿主基因组的耗竭是启动子处开放染色质扩展的原因。

转录分析表明，模式 I 与高表达基因相关，模式 II 与双向启动子的反义转录相关。通过 ChIPmentation 实验发现，HSV-1 感染导致模式 I 基因 + 1 核小体下游移位，模式 II 基因 - 1 核小体上游移位，这与酵母中 Pol II 降解导致 + 1 核小体移位的现象一致，且 α - amanitin 处理人细胞也有类似效果，说明 + 1 核小体移位是 Pol II 耗竭的普遍效应。

目前，HSV-1 感染时核小体定位变化的生物学意义尚不明确。虽然这种变化可能影响 Pol II 暂停位点的移位，或与组蛋白的动员有关，也可能影响转录因子的结合，但也可能只是 Pol II 耗竭的结果，无进一步功能作用。不过，这一发现对 HSV-1 感染或其他导致 Pol II 从基因组耗竭的条件下的染色质结构功能基因组学研究具有重要意义，提醒研究者在分析染色质可及性变化时，需考虑 Pol II 耗竭的影响，避免错误解读。

四、材料和方法

1. 分析已发表的测序数据：研究使用了此前发表的多种测序数据，包括 ATAC-seq、染色质相关 RNA-seq 和 H2A.Z ChIP-seq 数据，涉及 Mock 感染、不同 HSV-1 突变体感染以及 α - amanitin 处理的细胞，这些数据来自不同的研究，可在相应的 GEO 数据库中获取。
2. ChIPmentation、文库制备和测序：培养 HFF 细胞，感染相应病毒后，在 8 小时进行固定、裂解和超声破碎，使染色质片段化。将细胞裂解物与抗 H2A.Z 抗体孵育，用 Protein A 磁珠捕获抗体结合的片段，依次洗涤后进行标签化反应。反应产物经洗脱、去交联、酶处理后，进行 DNA 纯化和文库制备，最后在 NextSeq 500 上进行测序。
3. 读取比对：使用 Watchdog 工作流管理系统，下载公共测序数据并与人类基因组、HSV-1 基因组和人类 rRNA 序列进行比对。利用 ContextMap2 软件（以 BWA 为短读比对器）进行比对，允许一定的插入缺失和错配。将比对结果的 SAM 文件转换为 BAM 文件，计算读取覆盖度，并使用 RegCFinder 确定 ATAC-seq 和 H2A.Z ChIPmentation/-seq 数据中启动子窗口的差异子区域。
4. 质量控制：运用 samtools 统计映射读取数和映射到人类及 HSV-1 基因组的读取数，用 ATACseqQC 确定启动子 / 转录本体评分，通过 BEDTools 和 F-Seq 进行峰检测，使用 featureCounts 计算峰内读取比例，利用 ChIPseeker 对峰进行基因注释。
5. 数据绘图和统计分析：在 R 环境中进行数据绘图和统计分析，使用 Gviz 包创建读取覆盖度图，通过特定的 R 程序进行元基因分析和聚类分析，以探究染色质可及性变化的规律和特征。
6. 其他分析：根据 ATAC-seq 数据确定 dOCRs，从 RNA-seq 数据计算基因表达水平，使用 Homer 套件进行基序发现，利用 g:Profiler 和 gprofiler2 进行 GO 术语富集分析，通过 Fisher 精确检验进行基因类型和 ICP4 结合位点富集分析等，全面深入地分析数据，揭示 HSV-1 感染与宿主染色质之间的复杂关系。