新型双特异性 HIV-1 抑制剂：克服 PRO 140 局限，开辟抗艾新路径

《Journal of Virology 4.0》：Addition of a short HIV-1 fusion-inhibitory peptide to PRO 140 antibody dramatically increases its antiviral breadth and potency

这篇研究构建了 2P23-PRO140SC 和 2P23-PRO140-Fc 两种双功能融合蛋白。它们能高效抑制不同嗜性的 HIV-1 毒株及耐药突变体，且体内外活性良好。这为抗 HIV-1 治疗提供新方向，有望克服现有药物局限。

　　

新型双特异性 HIV-1 抑制剂的研发背景

艾滋病（AIDS）由人类免疫缺陷病毒 1 型（HIV-1）感染引发，严重威胁全球公共卫生。目前，联合抗逆转录病毒疗法（cART）虽能抑制 HIV-1 复制，但无法根除宿主细胞内整合的病毒，且长期使用存在副作用和耐药问题。因此，开发新型抗逆转录病毒药物迫在眉睫。

HIV-1 入侵细胞的过程极为关键，其包膜糖蛋白由表面亚基 gp120 和跨膜亚基 gp41 组成。gp120 负责与细胞受体 CD4 以及辅助受体 CCR5 或 CXCR4 结合，gp41 则介导病毒与细胞膜的融合，在这一过程中两个亚基会发生一系列构象变化。依据感染时辅助受体的使用情况，HIV-1 毒株可分为 CCR5 嗜性（R5）、CXCR4 嗜性（R4）和双嗜性（R5X4）病毒。CCR5 作为 HIV-1 进入细胞的主要辅助受体，自 1996 年被发现以来，一直是理想的药物靶点。

Maraviroc（MVC）是首个获批临床使用的 CCR5 拮抗剂，通过结合 CCR5 的疏水口袋抑制 HIV 进入细胞。PRO 140（Leronlimab）是一种人源化 IgG4 抗 CCR5 单克隆抗体（mAb），它通过竞争性结合 CCR5 的 N 端和细胞外环 2 结构域发挥作用，不影响 CCR5 的趋化因子受体活性。PRO 140 在 2006 年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的 “快速通道” 指定，多项临床研究对其单药治疗的抗逆转录病毒活性进行了评估。然而，PRO 140 和 MVC 一样，仅对 R5 病毒有效，对 R4 和 R5X4 病毒无效，治疗前需进行嗜性检测，这大大限制了其临床应用。

鉴于 HIV 的高变异性和耐药性，开发针对 HIV-1 入侵不同步骤的双特异性或多特异性抗逆转录病毒药物成为研究热点。此前研究设计出螺旋短肽（23 聚体）融合抑制剂 2P23，它具有强大的体外抗 HIV 活性和体内治疗效果。受此启发，本研究旨在开发同时靶向辅助受体 CCR5 和病毒融合蛋白 gp41 的双特异性 HIV-1 抑制剂，以克服 PRO 140 的局限性。

双特异性抑制剂的构建与表达

研究人员构建了两种串联融合蛋白 2P23-PRO140SC 和 2P23-PRO140-Fc。2P23-PRO140SC 是将融合抑制肽 2P23 通过甘氨酸 - 丝氨酸（GGGGS）连接子串联到 PRO 140 的单链可变片段（scFv，PRO140SC）上；2P23-PRO140-Fc 则是在 2P23-PRO140SC 的基础上，进一步融合人 IgG4 的结晶片段（Fc），并对 Fc 进行 M428L 和 N434S 突变。同时，构建了全长 PRO 140 抗体、PRO140SC 以及之前报道的双特异性融合蛋白 m36.4-PRO140 作为对照抑制剂。

这些重组蛋白抑制剂在人胚肾 293T 细胞（HEK293T）中表达，利用亲和层析法进行纯化。经十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，所有蛋白纯度高且大小正确；通过蛋白质免疫印迹（Western blot）分析，使用小鼠抗 2P23 肽单克隆抗体（5F7）验证了双特异性 2P23-PRO140SC 和 2P23-PRO140-Fc 的特异性。

双特异性抑制剂的功能特性研究

1. 与细胞膜的结合能力：采用流式细胞术检测 PRO 140 基于的抑制剂和 2P23 肽与表达 CCR5 细胞的结合能力。结果显示，四种基于 PRO-140 的抑制剂（PRO140SC、2P23-PRO140SC、2P23-PRO140-Fc 和 m36.4-PRO140）在饱和浓度 100 μg/mL 时，能高效结合细胞膜，抗 His 标签和 CCR5 双阳性细胞百分比达 100%。不同浓度测试表明，PRO140SC、2P23-PRO140SC 和 2P23-PRO140-Fc 的结合呈剂量依赖性，且不影响细胞表面 CCR5 的表达水平。这表明基于 PRO 140 的抑制剂可通过 CCR5 锚定高效结合细胞膜。
2. 对 CXCR4 嗜性 HIV-1 毒株的抑制活性：PRO 140 抗体仅能抑制 R5 型 HIV-1 毒株，研究人员探究了 2P23-PRO140SC 对 CXCR4 嗜性 HIV-1 毒株的抑制活性。选用两种 X4 病毒 NL4-3 和 CNE107 进行单周期感染实验，结果显示，PRO140SC 在高浓度（1,858.53 nM）下对这两种病毒的感染抑制作用不明显；2P23 肽对它们的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为 0.76 nM 和 3.64 nM；而 2P23-PRO140SC 对 NL4-3 和 CNE107 的抑制活性显著增强，IC₅₀分别为 0.01 nM 和 0.04 nM，比 2P23 肽的抑制活性高约 76 倍和 91 倍。此外，研究还发现对 PRO 140 抗体高度耐药的 R5 病毒 CNE49，对 2P23-PRO140SC 和 m36.4-PRO140 敏感。这表明添加 2P23 肽使 PRO 140 对 CXCR4 嗜性 HIV-1 毒株以及对 PRO 140 抗体不敏感的 R5 病毒具有高效抑制作用。
3. 对不同 HIV-1 亚型的广谱抗病毒活性：研究人员进一步评估基于 PRO 140 的抑制剂和 2P23 肽的抗病毒效力和广度。使用来自全球不同 HIV-1 亚型的包膜蛋白（Env）制备假病毒，进行单周期感染实验。结果显示，2P23、PRO 140 和 PRO140SC 对全球面板病毒的平均 IC₅₀值分别为 3.118 nM、7.28 nM 和 18.33 nM；而 2P23-PRO140SC 和 2P23-PRO140-Fc 的平均 IC₅₀值分别为 0.041 nM 和 0.235 nM。2P23-PRO140SC 比 2P23、PRO 140 和 PRO140SC 的抑制活性分别高 76 倍、178 倍和 447 倍；2P23-PRO140-Fc 的活性比 2P23-PRO140SC 低 5.7 倍。在针对中国流行的 HIV-1 亚型假病毒的实验中，也得到类似结果。此外，通过基于双分裂蛋白（DSP）的细胞融合实验发现，PRO140SC 对 R4 病毒 NL4-3 和 R5X4 病毒 R3A 的细胞融合抑制作用较弱，而 2P23、2P23-PRO140SC 和 m36.4-PRO140 能有效阻断细胞融合。使用三种具有复制能力的 HIV-1 病毒（X4 病毒 SG3.1、R5 病毒 JRCSF 和 R5/X4 病毒 89.6）进行实验，结果表明 2P23-PRO140SC 和 2P23-PRO140-Fc 在抑制病毒感染 TZM-b1 细胞和人外周血单个核细胞（PBMC）培养物方面表现出高效活性。这些结果表明，基于 PRO 140 和 2P23 的双特异性抑制剂具有强大且广谱的抗 HIV 活性。
4. 对耐药 HIV-1 突变体的抑制作用：研究人员此前报道了一组对 2P23 抑制剂耐药的 HIV-1 突变体，这些突变体在 gp41 靶位点存在单、双或三重突变。制备相应的突变假病毒并进行单周期感染实验，结果显示，突变病毒对 2P23 的抑制产生不同程度的耐药性，平均 IC₅₀为 21.132 nM，平均耐药倍数变化（FC）为 27.805 倍；但 2P23-PRO140SC 能有效抑制这些病毒，平均 IC₅₀为 0.025 nM，平均 FC 为 2.52 倍。对 T20 耐药突变体的研究也发现，2P23-PRO140SC 能高效抑制该组突变病毒。这表明 2P23-PRO140SC 是对 2P23 或 T20 耐药的 HIV-1 突变体的高效抑制剂。
5. 与其他双特异性抑制剂的协同作用：研究人员此前设计了融合蛋白 2P23-iMab，它通过靶向 CD4 的抗体 ibalizumab 发挥双功能抑制作用。鉴于两种锚定抗体的作用机制不同，研究人员探究 2P23-PRO140SC 与 2P23-iMab 是否具有协同抗 HIV 活性。实验结果显示，两者组合对 JRFL 和 NL4-3 的感染具有中度协同作用。同时，研究人员还探究了 2P23-PRO140SC 与 m36.4-PRO140 的协同作用，发现两者组合对 JRFL 感染有轻微协同作用，但对 NL4-3 感染有轻微拮抗作用。
6. 体外细胞毒性和稳定性：采用标准的 CCK8 实验检测 2P23-PRO140SC、2P23-PRO140-Fc、2P23、PRO140SC 和 m36.4-PRO140 的体外细胞毒性。结果显示，这些抑制剂在高浓度下对 TZM-bl 细胞均无明显细胞毒性，治疗指数（IC₅₀/CC₅₀）较高。在人 PBMC 实验中，2P23-PRO140SC 虽未表现出明显细胞毒性，但会导致细胞活力一定程度下降且变化较大。在代谢稳定性研究中，2P23-PRO140SC 在 37°C 储存时抗病毒效力随时间显著降低，而 2P23-PRO140-Fc 对温度处理耐受性良好；两种蛋白对大鼠血清处理均具有高度抗性，IC₅₀值几乎不变；但经胰蛋白酶消化后，它们的抗病毒活性严重受损。
7. 体内抗病毒活性：在 SD 大鼠模型中评估 2P23-PRO140SC 和 2P23-PRO140-Fc 的体内抗 HIV 性能。将 10 只 SD 大鼠分为两组，每组 5 只，分别皮下注射融合蛋白（3 mg/kg），在不同时间点采集血液，通过单周期感染实验测量抗 HIV 活性。结果显示，2P23-PRO140SC 在注射后 1 h 血清抗 HIV 活性迅速升高，4 h 达到峰值；2P23-PRO140-Fc 在注射后 8 h 血清稀释倍数达到 243 倍，24 - 48 h 达到峰值，且在注射 96 h 后仍保留抑制活性。这表明 2P23-PRO140-Fc 具有增强的体内抗病毒活性和延长的半衰期。

研究总结与展望

本研究通过将融合抑制肽 2P23 与 PRO 140 抗体的 scFv 基因连接，成功构建了两种双特异性 HIV-1 抑制剂 2P23-PRO140SC 和 2P23-PRO140-Fc。它们不仅对 CCR5 嗜性病毒有效，对 CXCR4 嗜性 HIV-1 病毒也具有显著抑制作用，还能高效抑制对 2P23 和 T20 耐药的 HIV-1 变异体。2P23-PRO140SC 与其他双特异性抑制剂存在协同作用，且两种融合蛋白体外细胞毒性低，在大鼠体内具有高抗 HIV 活性，2P23-PRO140-Fc 表现更优。

然而，目前的研究仍存在一些局限性。首先，需要进一步明确融合蛋白强大抗 HIV 活性的机制，例如它们如何调节时空关系以克服病毒 - 细胞融合过程中的空间位阻。其次，在进一步开发前，需深入研究融合蛋白在动物模型中的体内药代动力学、安全性和治疗效果。虽然抑制剂的剂量依赖性细胞膜锚定不影响 CCR5 受体表达水平，但 TZM-bl 细胞上的表达水平可能远高于体内主要靶细胞 —— 初级 CD4⁺T 细胞上的表达水平。此外，研究人员还关注能否将 2P23 肽直接连接到 PRO 140 的原型抗体上，在保持基于 scFv 的融合蛋白抗病毒效力的同时，增强其体内稳定性。

从长远来看，由于病毒储存库的持续存在，实现 HIV 的功能性治愈是当前治疗的目标。虽然异基因造血干细胞移植（HSCT）联合纯合 CCR5Δ32 突变（CCR5^Δ32/Δ32）已使部分患者实现功能性治愈，但该方法受限于 CCR5^Δ32供体数量少和治疗安全性问题，不适用于大多数 HIV 感染患者。因此，针对 CCR5 的 HIV-1 功能性治愈替代策略成为研究重点。本研究提出可利用慢病毒载体和腺相关病毒载体等遗传载体，将 2P23-PRO140SC 和 / 或 2P23-PRO140-Fc 用于 CCR5 靶向基因治疗。目前，研究人员正在开展相关项目，旨在生成能分泌 2P23-PRO140SC 分子的 HIV 抗性细胞。

综上所述，本研究为潜在的临床开发提供了双特异性 HIV-1 抑制剂，也为研究 HIV-1 入侵机制及其抑制提供了新工具，为未来抗 HIV-1 治疗的发展奠定了重要基础。