非感染性 CD4+T 细胞助力巨噬细胞中 HIV-1 复制与 VCC 形成：攻克 HIV 感染新视角

《Journal of Virology 4.0》：CD4+ T cells facilitate replication of primary HIV-1 strains in macrophages and formation of macrophage internal virus-containing compartments

HIV（人类免疫缺陷病毒）感染是全球重大健康难题。这篇研究聚焦 HIV-1 感染的巨噬细胞与 CD4+T 细胞的相互作用，发现非感染性 CD4+T 细胞可促进原代 HIV-1 在巨噬细胞中复制并形成 VCCs（病毒储存区室），为攻克 HIV 感染提供新方向，值得关注。

　　

研究背景

自 1983 年人类免疫缺陷病毒（HIV）被确认为获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的病原体以来，其在全球广泛传播，已导致超 8500 万人感染，4000 万人因艾滋病相关疾病死亡。HIV 主要感染表达 CD4 受体及 CCR5 或 CXCR4 共受体的 CD4⁺T 细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。长期感染会使 CD4⁺T 细胞大量耗竭，导致细胞免疫功能丧失，引发艾滋病。

高效抗逆转录病毒疗法（ART）虽能抑制病毒复制、降低血浆病毒载量、恢复患者预期寿命，但需终身服用且有副作用，目前仍无 HIV 疫苗和能彻底清除病毒的治愈方法，因此深入了解 HIV-1 的持续存在和传播机制至关重要。

巨噬细胞在 HIV-1 感染过程中发挥重要作用，它是性传播时最早接触 HIV-1 的细胞之一，能吞噬病原体并运输到引流淋巴结，激活免疫反应。同时，巨噬细胞可被 HIV-1 有效感染并成为病毒储存库，其内部的病毒储存区室（VCCs）结构复杂，可保护病毒免受细胞外环境影响，且 HIV-1 能通过 VCCs 快速感染 T 细胞。

此前研究多使用实验室适应的 HIV-1 菌株，这些菌株虽便于研究，但可能丢失原代 HIV-1 菌株的重要特征。原代 HIV-1 菌株直接从患者血浆标本中分离，更能反映真实感染情况。然而，目前对原代 HIV-1 菌株在体内相关靶细胞中的复制和传播模式，尤其是感染的单核细胞来源巨噬细胞（MDM）与未感染的 CD4⁺T 细胞之间的相互作用和病毒传播机制了解不足，本研究旨在填补这一空白。

材料和方法

1. 细胞系：使用 HEK-293T 细胞，在特定培养基中培养，添加胎牛血清（FCS）、抗生素等，置于 37°C、90% 湿度、5% CO₂的环境中。
2. HIV-1 构建体：采用多种已报道的感染性分子克隆，如 pHIV-1 AD8、pYK-JRCSF 等。
3. 病毒原液制备：将 HEK-293T 细胞接种于 6 孔板，转染相应 HIV-1 分子克隆，通过钙磷酸法转染，16 小时后换液，24 小时后收集含有 HIV-1 原液的上清液并离心去除杂质，使用内部 p24 酶联免疫吸附测定（ELISA）对 HIV-1 原液进行定量。制备含 SIV VPX 的病毒样颗粒（VPX-VLPs）时，转染 pSIV_Vpx1 和 pHIT-G，按相同步骤收集上清液。
4. 原代人单核细胞来源巨噬细胞的分离与分化：从血沉棕黄层获取外周血单个核细胞（PBMCs），经 Ficoll-Paque PLUS 密度梯度离心分离，将 PBMCs 接种于培养皿，在特定培养基中培养，通过塑料贴壁法使单核细胞分化为 MDM，经多次洗涤和进一步分化后，用 Accutase 消化获取 MDM。
5. 原代人 CD4⁺T 细胞的分离与培养：利用 RosetteSep Human CD4⁺T Cell Enrichment Cocktail 从血沉棕黄层分离 CD4⁺T 细胞，在含多种成分的培养基中培养，感染前用含白细胞介素 - 2（IL-2）和菜豆凝集素（PHA）的培养基刺激 3 天进行活化和扩增。
6. MDM 和 CD4⁺T 细胞感染实验：将 MDM 接种于 96 孔板，24 小时后用 VPX-VLPs 预处理 2 小时，然后用不同浓度 p24 的 HIV-1 菌株感染 16 小时；将预刺激的原代 CD4⁺T 细胞接种于 96 孔板，用 HIV-1 菌株感染 4 - 6 小时。分别在感染后不同时间点分析细胞内和上清液中的 HIV-1 复制情况。
7. MDM 和 CD4⁺T 细胞共培养感染实验：MDM 接种、预处理和感染步骤同前，4 天后加入经 PHA 和 IL-2 预刺激的 CD4⁺T 细胞，按 1:10 比例共培养，8 天后分析 CD4⁺T 细胞、MDM 和上清液中的 HIV-1 复制情况。
8. 不同条件下 MDM 和 CD4⁺T 细胞共培养感染实验：在共培养实验基础上，设置 ART（使用拉替拉韦或奈韦拉平）、广泛中和抗体（bnAbs，如 3BNC117、PG9、10-1074）、抗 CD4 单克隆抗体（a-CD4 mAB）等处理组，在相应条件下共培养并分析 HIV-1 复制情况。
9. Transwell 共培养实验：将 MDM 接种于 24 孔 Transwell 板，预处理和感染后，4 天加入经 PHA 和 IL-2 预刺激的 CD4⁺T 细胞，分为直接接触和通过 Transwell 插入物（0.4μm 孔径）隔开两种方式，8 天后分析 HIV-1 复制情况。
10. HIV-1 在 MDM 中复制的定量分析：去除细胞培养上清液中的 CD4⁺T 细胞，洗涤 MDM，用多聚甲醛（PFA）固定，皂苷（Saponin）透化，牛血清白蛋白（FCS）封闭，用抗 HIV-Gag 抗体和相应二抗染色，DAPI 染核，通过荧光显微镜成像，使用 Gen5 软件分析。
11. MDM 的高分辨率成像：将 MDM 接种于含盖玻片的 12 孔板，预处理和感染后，在不同培养条件下培养，8 天后固定、透化、封闭，用抗 HIV-Gag 抗体、抗 CD81 抗体及相应二抗染色，DAPI 染核，使用 DeltaVision OMX SR 显微镜成像，IMARIS 9.3.0 软件分析。
12. HIV-1 在 CD4⁺T 细胞中复制的定量分析：固定 CD4⁺T 细胞，用甲醇透化，FCS 封闭，用抗 HIV-Gag 抗体染色，使用 MACSQuant VYB Analyzer 和 Flow Logic 软件分析。
13. HIV-1 释放到上清液中的定量分析：用 Triton X-100 裂解病毒原液或细胞培养上清液，包被抗 HIV-1 p24 单克隆抗体，封闭后制作标准曲线，加入样品和相应抗体，使用 SureBlue TBM Peroxidase Substrate 检测，用硫酸终止反应，通过酶标仪测量吸光度，计算 p24 浓度。
14. MDM 中 SamHD1 蛋白表达的定量分析：将 MDM 接种于不同孔板，预处理后在不同条件下培养，固定、透化、封闭，用抗 SamHD1 抗体或抗磷酸化 SamHD1 抗体染色，使用 MACSQuant VYB Analyzer 和 Flow Logic 软件分析。
15. 统计分析：使用 GraphPad Prism 9.4.1 进行统计计算，数据以至少三次独立实验的平均值 ± 标准误（SEM）表示，通过简单线性回归分析相关性，展示皮尔逊相关系数和 P 值。

研究结果

1. CD4⁺T 细胞支持原代患者来源 HIV-1 菌株复制，巨噬细胞则不然：选用多种 HIV-1 菌株，包括实验室适应菌株和原代菌株，对 MDM 和 CD4⁺T 细胞进行感染实验。结果显示，实验室适应的 R5 嗜性 AD8 和 NL4-3 在 MDM 中感染率较高，而原代 HIV-1 菌株在 MDM 中的感染和传播能力严重受损，仅 CH058 有低水平感染。相反，所有菌株在 CD4⁺T 细胞中均能有效复制。通过检测细胞培养上清液中的 p24 水平也得到了一致结果，表明原代菌株在巨噬细胞感染和 p24 产生方面存在缺陷。
2. HIV-1 感染的巨噬细胞与 CD4⁺T 细胞共培养促进病毒复制：将感染不同 HIV-1 菌株的 MDM 与未感染的 CD4⁺T 细胞共培养，发现共培养显著提高了 MDM 中病毒感染水平，CD4⁺T 细胞感染率和上清液中 p24 产量也相应增加。原代菌株在共培养时感染率提升更为明显，如 CH077 在 50 ng p24 接种量下，共培养时感染率可达～20%，而单独培养时几乎无感染。添加 ART 可抑制这种增强效应，证实共培养确实促进了病毒复制。
3. CD4⁺T 细胞通过细胞间接触以 CD4 和 GP120 依赖的方式增强 HIV-1 在巨噬细胞中的复制：利用 Transwell 实验表明，CD4⁺T 细胞与巨噬细胞直接接触是增强 HIV-1 感染的必要条件，当二者被 Transwell 插入物隔开时，无法观察到感染增强现象。CD4⁺T 细胞经 PHA 预刺激对增强巨噬细胞 HIV-1 感染至关重要，未预刺激的 CD4⁺T 细胞对巨噬细胞感染增强作用不明显。

使用抗 CD4 抗体 RPA-T4 处理发现，该抗体阻断 CD4 与 GP120 的相互作用并抑制 T 细胞激活，却能增加巨噬细胞中 HIV-1 的产生，模拟了 CD4⁺T 细胞共培养的增强效果，且与 CD4⁺T 细胞共培养具有协同作用。这表明 CD4⁺T 细胞增强巨噬细胞 HIV-1 感染并非主要通过病毒在 CD4⁺T 细胞中的扩增和再传播，可能涉及 CD4:TCR 与 MHCII 轴等多层细胞机制。

不同 bnAbs 对 CD4⁺T 细胞介导的巨噬细胞感染增强作用影响不同，且与病毒菌株有关。3BNC117 和 10-1074 对实验室适应菌株 NL4-3 的 CD4⁺T 细胞感染有完全中和作用，PG9 对原代菌株 THRO 和 CH077 的病毒传播抑制效果较好。bnAbs 处理不仅阻断了 HIV-1 从巨噬细胞向 CD4⁺T 细胞的传播，还破坏了 CD4⁺T 细胞介导的巨噬细胞中 HIV-1 复制的增强作用。4. CD4⁺T 细胞诱导 HIV-1 感染的 MDM 中 VCCs 形成，且与病毒复制相关：以往 VCCs 形成的研究多集中于实验室适应菌株，本研究首次评估原代 HIV-1 菌株在巨噬细胞中形成 VCCs 的能力。结果显示，原代菌株单独感染 MDM 时，几乎不形成 VCCs，而与未感染的 CD4⁺T 细胞共培养后，可诱导 VCCs 形成，但数量和显著性低于实验室适应菌株。

通过量化 VCCs 总面积与细胞数量的比值发现，共培养能显著促进 VCCs 形成。进一步分析发现，VCCs 面积与 HIV-1 复制率在多种菌株中均存在相关性，无论是共培养还是单独培养的巨噬细胞。这表明原代 HIV-1 菌株在巨噬细胞中的复制与 VCCs 形成密切相关，共培养可促进二者发生。

讨论

HIV-1 治疗和治愈面临的重大挑战是控制病毒在细胞储存库中的长期持续存在，包括 CD4⁺记忆 T 细胞和组织驻留巨噬细胞。了解病毒在这些细胞中的传播和复制激活模式至关重要，且研究应纳入原代 HIV-1 分离株。

以往研究表明，T/F 病毒感染巨噬细胞效率低，但在 CD4⁺T 细胞中复制明显，细胞间传播可克服巨噬细胞感染障碍。本研究发现，实验室适应菌株在巨噬细胞中复制无需 CD4⁺T 细胞共培养，而原代 HIV-1 菌株在巨噬细胞中的复制依赖于未感染的 CD4⁺T 细胞，且需要直接细胞相互作用和 CD4⁺T 细胞预激活。抗 CD4 抗体 RPA-T4 的实验结果提示，CD4:MHCII 轴及其他细胞间相互作用可能参与其中，但具体机制有待进一步研究。

不同中和抗体对巨噬细胞和 CD4⁺T 细胞共培养感染的抑制活性存在差异。bnAbs 对 MDM 单培养感染率无影响，因为 VCCs 可保护病毒免受 bnAbs 作用。在细胞间传播方面，不同 bnAbs 对不同菌株的效果不同，PG9 对原代菌株的病毒传播抑制作用较好，而 3BNC117 和 10-1074 对原代菌株的中和作用有限，这凸显了评估 bnAbs 治疗效果时考虑病毒菌株和传播模式的重要性。

本研究还证实，巨噬细胞中病毒复制与 VCCs 形成密切相关。VCCs 是 HIV-1 的储存和传播场所，能保护病毒免受中和抗体作用，给 HIV-1 清除策略带来挑战。原代 HIV-1 菌株需与未感染的 CD4⁺T 细胞共培养才能在巨噬细胞中形成 VCCs 并复制，提示 T 细胞在建立巨噬细胞病毒储存库中起关键作用。

综上所述，原代患者来源的 HIV-1 菌株在与自体未感染 T 细胞共培养时，可在巨噬细胞中形成 VCCs，且该过程与病毒复制相关。这强调了 VCCs 在患者来源 HIV-1 在巨噬细胞中复制的重要性，非感染性 CD4⁺T 细胞通过 CD4 和 GP120 依赖的方式促进这一过程。鉴于巨噬细胞作为病毒储存库的重要作用，开发针对 VCCs 及其形成过程的策略，结合减少 CD4⁺T 细胞中潜伏 HIV-1 负担的治疗方法，可能是实现 HIV-1 功能性治愈的关键。