新发现！“VILMIR”—— 调控呼吸道病毒感染免疫反应的关键长链非编码 RNA

《Journal of Virology 4.0》：Human long noncoding RNA VILMIR is induced by major respiratory viral infections and modulates the host interferon response

本文发现了一种此前未被表征的长链非编码 RNA（lncRNA）—— 病毒诱导的干扰素反应调节因子（VILMIR），它在流感、新冠病毒等感染后上调，且影响宿主干扰素反应，有望成为呼吸道病毒感染潜在治疗靶点，为相关研究提供新思路。

　　

引言

在人类基因组中，蛋白质编码基因仅占不到 2%，而约 80% 的基因组可转录为非编码 RNA（ncRNAs），其中长链非编码 RNA（lncRNAs）是最大的一类 ncRNAs 。尽管其功能鉴定存在挑战，但 lncRNAs 已成为生物过程的关键调节因子，在宿主抗病毒和免疫反应中发挥重要作用。本研究通过挖掘大规模公共 RNA 测序（RNA-seq）数据，发现了一种此前未被表征的人类 lncRNA—— 病毒诱导的干扰素反应调节因子（VILMIR），它在多种呼吸道病毒感染和干扰素 -β（IFN-β）治疗后上调，且影响宿主对这些刺激的反应，为呼吸道病毒感染的研究提供了新方向。

材料和方法

1. RNA 测序数据分析：从公共流感感染实验的基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus）收集 121 个批量 RNA-seq 样本，涵盖 4 种人类呼吸道上皮细胞系和 10 种流感病毒株。样本经 STAR 软件比对到人类基因组组装 38（Hg38），原始基因计数过滤后，用 voom 分位数归一化方法进行归一化。通过设定差异表达标准筛选出与流感病毒（IAV）感染相关的 lncRNAs。此外，还对 78 个单端 RNA-seq 样本进行分析，以研究 VILMIR 在其他条件下的差异表达。
2. 细胞培养：使用多种细胞系，包括 A549 肺上皮细胞、SUP-T1 T 淋巴细胞、THP-1 单核细胞等，在不同的培养基中培养，并置于 37°C、5% CO₂的培养箱中。
3. 流感病毒库存：在 MDCK 细胞中繁殖流感 A / 加利福尼亚 / 04/2009（H1N1）病毒，通过组织培养感染剂量（TCID₅₀）测定病毒滴度。
4. 病毒感染：A549 细胞接种病毒或模拟接种，感染 1 小时后更换培养基，在指定时间点提取 RNA 进行分析。
5. 干扰素处理：不同细胞系用或不用人 IFN-β 重组蛋白处理，在指定时间点收获细胞提取 RNA。
6. RNA 分离和定量 PCR：用 TRIzol 法提取总 RNA，定量后逆转录为 cDNA，进行定量 PCR（qPCR），以 GAPDH 或 18S 作为内参，分析基因相对表达。
7. 5′ 和 3′ 快速扩增 cDNA 末端（RACE）：对 VILMIR 进行 5′ 和 3′ RACE，验证其转录本边界和注释，5′ RACE 按试剂盒说明进行，3′ RACE 采用不同方法，最后对产物进行克隆和测序。
8. 细胞质和细胞核 RNA 的分离：用 RNA 亚细胞分离试剂盒制备细胞质、细胞核和总 RNA，通过 qPCR 分析 VILMIR 在不同细胞组分中的表达。
9. 蛋白质提取和 Western 印迹：收集细胞蛋白裂解物，进行蛋白质定量，SDS-PAGE 凝胶电泳后转膜，用一抗和二抗孵育，化学发光检测，并用 ImageJ 软件进行密度分析。
10. 质粒和克隆：构建 dCas9-KRAB、绿色荧光蛋白（GFP）过表达和向导 RNA（gRNA）等质粒，设计针对 STAT1 和 VILMIR 的 gRNA 序列并进行克隆。
11. dCas9-KRAB 细胞系构建和验证：通过共转染 HEK-293FT 细胞产生慢病毒，感染 A549 细胞并筛选，建立稳定细胞系，用于后续实验。
12. 单细胞 RNA-seq 数据分析：收集 SARS-CoV-2 感染和未感染的单细胞 RNA-seq 样本，用 Cell Ranger 软件比对测序 reads，用 Seurat R 包进行细胞类型注释和分析。
13. cDNA 文库构建、RNA 测序和 Ingenuity 通路分析（IPA）：对不同处理的 A549 细胞进行 mRNA 测序，构建文库并测序，用 STAR 软件比对，edgeR 软件归一化，limma-trend 方法进行差异基因表达分析，用 IPA 进行通路和疾病功能富集分析。

结果

1. 人类 lncRNA VILMIR 在流感感染后持续上调：通过对 121 个 RNA-seq 样本的分析，筛选出 15 个候选 ncRNA 基因和 98 个蛋白质编码基因，其中 VILMIR 在所有 RNA-seq 条件下流感感染后均显著上调。经 5′ 和 3′ RACE 验证，VILMIR 与 Hg38 GENCODE V45 注释匹配，其编码潜力低。RNA 分馏实验表明 VILMIR 分布在细胞核和细胞质中。RT-qPCR 实验进一步证实，A549 细胞感染 H1N1 病毒后，VILMIR 在 6 小时后显著上调，18 小时达到高峰，24 小时后因细胞死亡而下降。
2. VILMIR 在多种呼吸道病毒感染中表达上调：分析额外的 RNA-seq 数据发现，VILMIR 在呼吸道合胞病毒（RSV）、SARS-CoV-2 感染以及 IFN-β 治疗后的样本中均上调。当宿主干扰素反应受抑制时，VILMIR 上调程度降低，这表明 VILMIR 可能受多种途径调节。
3. VILMIR 是一种干扰素刺激基因，与 I 型 IFN 反应相关：A549 细胞用不同浓度 IFN-β 处理后，VILMIR 表达呈剂量和时间依赖性增加。ENCODE 3 的转录因子 ChIP-seq 分析显示，VILMIR 5′ 端附近有 RELB、IRF1、STAT1、STAT2 和 STAT3 的结合位点。敲低 STAT1 后，VILMIR 表达部分降低，提示 STAT1 对 VILMIR 有一定调节作用。在 IFNAR1 敲除的 Huh7 细胞中，IFN-β 处理后 VILMIR 和典型的干扰素刺激基因（ISG）GBP1 的表达均被消除，证实 VILMIR 是一种与 I 型 IFN 反应密切相关的 ISG。
4. VILMIR 在免疫细胞类型中感染 SARS-CoV-2 和 IFN-β 治疗后上调：对 COVID-19 患者支气管肺泡灌洗液（BALF）的单细胞 RNA-seq 数据分析发现，VILMIR 在多种免疫细胞类型（如巨噬细胞、T 细胞等）中表达，且在 SARS-CoV-2 感染样本中的表达高于未感染样本。体外实验中，SUP-T1 T 细胞和 THP-1 单核细胞用 IFN-β 处理后，VILMIR 表达显著上调，表明 VILMIR 可在免疫细胞中被激活。
5. 敲低 VILMIR 减弱 A549 上皮细胞对 IFN-β 治疗的宿主反应：用 CRISPRi 抑制 A549 细胞中 VILMIR 的表达，RNA-seq 分析显示，VILMIR 敲低（KD）后，2325 个基因对 IFN-β 治疗的表达变化受到影响，多数基因表达变化幅度减小，整体趋势与 STAT1 敲低相似，提示 VILMIR 可能在 IFN 反应中起激活作用。IPA 分析发现，VILMIR KD 影响的差异表达基因（DEGs）富集在多个与干扰素相关的通路以及细胞介导免疫和细胞因子信号通路等。进一步筛选出 78 个基因，其中 ISGs 如 IFIT2 和 IFI44L 在 VILMIR KD 后对 IFN-β 治疗的反应降低，表明 VILMIR 可广泛减弱 A549 上皮细胞对干扰素治疗的宿主反应。
6. VILMIR 敲低也降低 A549 上皮细胞对甲型流感感染的宿主反应：用甲型流感病毒（IAV）H1N1 CA/09 株感染 A549 VILMIR KD 细胞，RNA-seq 分析发现，3068 个基因对 H1N1 感染的表达变化受到影响，多数基因表达变化幅度减小，且与 STAT1 敲低趋势相似。筛选出 162 个基因，其中 IFI6 和 CD274 在 VILMIR KD 后对 H1N1 感染的反应降低。IPA 分析发现，VILMIR KD 在 IFN-β 治疗和 H1N1 感染中影响的 DEGs 存在共同富集的通路，如 I 类 MHC 介导的抗原加工和呈递等，还发现一些仅在 H1N1 感染中富集的通路，表明 VILMIR 在干扰素和抗病毒反应中可能发挥共同调节作用，且影响更广泛的宿主反应。

讨论

本研究通过大规模 RNA-seq 分析，鉴定出 VILMIR 在多种呼吸道病毒感染和 IFN-β 治疗后显著上调，它是一种 ISG，与 I 型 IFN 反应密切相关，且在多种免疫细胞中表达。敲低 VILMIR 可减弱宿主对 IFN-β 治疗和 IAV H1N1 感染的转录反应，但具体调节机制仍需进一步研究。

虽然 VILMIR 在宿主干扰素反应受抑制时表达降低，但不完全依赖于 STAT1，可能受多种转录因子和信号通路调节。VILMIR 在多种免疫细胞中的上调表明其在免疫反应中具有更广泛的作用，需进一步研究其在体内的功能影响。

VILMIR 敲低导致的基因表达变化幅度虽小，但可能具有重要生物学意义。它可能在转录后水平发挥作用，且由于 ISGs 的冗余性，单个 ISG 的敲低可能不会导致明显的抗病毒效果变化。此外，CRISPRi 实验中不同 gRNA 导致的差异可能是由于脱靶效应或基因插入变异，未来研究需要明确 VILMIR 直接调节的基因和通路。

总之，VILMIR 作为一种新发现的 ISG，与宿主对呼吸道病毒感染的免疫反应密切相关，其功能研究有望为理解宿主 - 病原体相互作用提供新视角，为开发治疗呼吸道病毒感染的新方法奠定基础。