自动化 cobas MTB 检测及 RIF/INH 耐药检测在结核病诊断中的卓越效能与关键意义

《Journal of Clinical Microbiology》：Evaluation of the cobas MTB and MTB-RIF/INH assay in clinical samples for the detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens

这篇研究评估了自动化 cobas MTB-Real-Time PCR 检测临床标本中结核分枝杆菌复合群（MTBC）的性能，以及 cobas MTB-RIF/INH 检测利福平（RIF）和异烟肼（INH）耐药性的能力。结果表明该检测可靠且通用，对结核病防控意义重大。

　　### 结核病现状与研究目的
结核病（TB）是全球重要的公共卫生问题，在传染病致死病因中仅次于 COVID-19。2022 年，全球约 1060 万人患病，130 万人死亡，德国的发病率为 4.9/10 万，且多药耐药（MDR）结核病比例呈上升趋势 。快速诊断结核病患者并确定其耐药情况，对防控结核病传播、减轻疾病负担至关重要。本研究旨在评估 cobas MTB-Real-Time PCR 检测在低发病率国家临床标本中快速直接检测结核分枝杆菌复合群（MTBC）的性能，以及 cobas MTB-RIF/INH 检测对利福平（RIF）和异烟肼（INH）耐药性的检测能力，将 PCR 检测结果与液体培养（BACTEC MGIT 960 TB 系统作为金标准）、线性探针检测（LPA）或测序结果以及表型药敏试验（DST）进行对比。

材料与方法

1. 样本处理：研究在德国的 Laboratory Limbach Heidelberg 进行，使用 500 份经 N - 乙酰 - L - 半胱氨酸 / 氢氧化钠（NALC-NaOH）处理的痰液样本，这些样本均为标准护理检测剩余的匿名样本。样本先进行直接荧光涂片显微镜检查（金胺染色），再用 NALC/NaOH 溶液去污，随后将 500μL 磷酸盐缓冲悬液用于接种液体培养（BACTEC MGIT 960），100μL 分别接种在两种固体培养基（改良罗氏培养基等）上。对于阳性培养物，通过涂片显微镜检查（萋 - 尼氏染色法）分析，并接种在血琼脂平板上检测 / 排除污染。利用线性探针检测（GenoType MTBC 和 GenoType Mycobacteria CM/AS）对培养阳性标本中的抗酸杆菌进行菌种鉴定，若检测到 MTBC 分离株，则使用 BACTEC MGIT 960 进行 RIF 和 INH 的药敏试验，同时通过相关基因的分子分析（GenoType MTBDR、桑格测序）确认耐药的分子机制。
2. 耐药性检测：鉴于德国结核病耐药率较低，研究选用一组在 rpoB、katG 和 inhA 基因区域具有选定耐药突变的结核分枝杆菌菌株，评估 cobas MTB-RIF/INH 检测耐药相关突变的性能。这些菌株来自标准护理诊断实验室的德国患者，预先通过 LPA、桑格测序和表型药敏试验进行了特征分析，将在改良罗氏培养基上生长的菌株用 NaCl 溶液稀释至 103CFU/mL 后用于 cobas MTB 检测。
3. cobas MTB 检测流程：准备和设置 cobas MTB 及 cobas MTB-RIF/INH 检测时，将 0.4mL 经 NALC-NaOH 预处理的样本转移至含有 2mL cobas 微生物灭活溶液的 5mL 聚丙烯管中，涡旋 30 - 60s，室温（22℃ - 25°C）孵育至少 60min，再次涡旋 30s，然后超声处理、3000×g 离心 1min，直接转移至全自动 cobas 6800 仪器（罗氏）中，cobas MTB-RIF/INH 检测按制造商说明进行。
4. 统计分析：以 MTB 培养结果为金标准，将 cobas MTB RIF/INH 检测数据分为真阳性、假阳性、真阴性和假阴性四类。使用 2×2 列联表计算敏感性、特异性和双侧 95% 置信区间（CI），统计计算通过 MedCalc 软件完成。

结果

1. MTBC 检测性能：对 500 份患者的肺部标本进行 cobas MTB 检测，其中 49 份 MTB 培养阳性，45 份 cobas MTB 检测结果与之相符，包括 22 份抗酸杆菌（AFB）涂片阳性和 23 份 AFB 涂片阴性标本；4 份培养阳性但 PCR 检测阴性，且 AFB 涂片均为阴性。451 份 MTB 培养阴性标本中，3 份 PCR 检测阳性（Ct 值 > 32），5 份初始检测结果无效（内部控制阴性），重新检测后有效。肺部标本 MTBC 检测的敏感性为 91.8%，特异性为 99.3%；AFB 涂片阳性标本的敏感性为 100%，涂片阴性标本的敏感性为 85.1%。涂片阳性 PCR 阳性标本的平均 Ct 值为 29.5（±2.9；22.5 - 34.4），涂片阴性 PCR 阳性标本的平均 Ct 值为 30.8（±1.8；27.9 - 33.4）。
2. 耐药性检测结果：仅对 cobas MTB 检测阳性的标本进行 cobas MTB-RIF/INH 检测，并与表型 DST 对比。49 份 cobas MTB 检测阳性标本中，3 份 cobas MTB-RIF/INH 检测结果无效，可能是由于之前 cobas MTB 检测中 MTB 的 DNA 浓度过低，无法分析耐药基因。剩余 46 份标本的表型和分子检测结果在 INH 和 RIF 敏感性方面一致。在分析 34 株具有不同 rpoB、inhA 或 katG 基因突变的结核分枝杆菌菌株时，21 株携带临床相关 INH 耐药突变的菌株中，19 株被正确鉴定为 INH 阳性（耐药），13 株 INH 敏感菌株均被正确鉴定为 INH 阴性；24 株携带 1 或 2 个 rpoB 基因突变的菌株中，22 株被正确鉴定为 RIF 阳性（耐药），10 株无 rpoB 突变的菌株被正确鉴定为 RIF 阴性（敏感）。未被检测出的 INH 耐药菌株中，一株存在野生型和突变型混合的情况，另一株在 inhA -15 区域存在未进一步鉴定的突变；未被检测出的 RIF 耐药菌株携带 rpoB T508A（=T427A）和 rpoB L533V（=L452V）突变，这两种突变较为罕见，且 T508A 突变可能不导致耐药。

讨论

1. cobas MTB 检测的优势与局限性：本研究中 cobas MTB 检测在处理后的痰液标本中检测 MTB 的整体敏感性和特异性与其他检测系统相比具有优势，甚至优于 Xpert MTB/RIF 等系统。对于涂片阴性、培养阳性的标本，其敏感性也较高，有助于减少因 MTB 培养结果延迟导致的结核病传播。然而，该检测存在 3 例假阳性结果，可能是检测到了非存活杆菌的 DNA，且由于缺乏患者完整病史，无法进一步分析。
2. cobas MTB RIF/INH 检测的性能分析：cobas MTB RIF/INH 检测在 MTB 阳性标本中检测 RIF 和 INH 耐药性的性能良好，在低流行率研究环境中，所有药物敏感的临床样本均被正确鉴定。分析不同突变菌株时发现，检测未识别部分罕见突变菌株，可能是由于检测探针未覆盖相关突变或突变的临床意义不明确。对于一些所谓的临界突变菌株，检测虽显示阳性（耐药）结果，但表型上对 RIF 敏感，这种差异需通过 rpoB 基因序列分析来区分。
3. 检测系统的特点与应用前景：cobas MTB 和 cobas MTB-RIF/INH 检测在全自动 cobas 6800 系统上进行，该系统通量高，可在 8 小时内处理多达 384 个样本，且操作流程简单，样本经灭活、超声处理后直接上机，自动完成 DNA 提取、扩增、检测和结果生成，总检测时间为 2 小时 30 分钟，与其他平台相当。此外，新推出的较小的 cobas 5800 系统更适用于小型实验室。综合来看，cobas MTB 检测在不同实验室环境中对 MTB 检测及 RIF/INH 耐药性检测具有良好的应用前景。

致谢

本研究由罗氏分子系统（美国加利福尼亚州普莱森顿）资助，UE 从罗氏获得演讲酬金，其他作者无利益冲突声明。