碱性自养条件下铁循环微生物引发的钢丝厌氧腐蚀研究及其对核废料处置的影响

《Applied and Environmental Microbiology》：Anaerobic corrosion of steel wire by Geoalkalibacter ferrihydriticus under alkaline autotrophic conditions

本文聚焦微生物诱导腐蚀（MIC），以 Geoalkalibacter ferrihydriticus 为研究对象，发现其在 pH 9.5 厌氧自养条件下可利用钢丝中 Fe0，引发钢丝腐蚀并产 H2。该研究揭示了碱性厌氧环境下 MIC 的新机制，对核废料处置等领域意义重大。

　　### 微生物诱导腐蚀（MIC）研究背景
铁的腐蚀是一个严重的经济和环境问题。在有氧条件下，铁的腐蚀主要是化学过程；而在缺氧条件下，大多由微生物代谢活动引起，即微生物诱导腐蚀（MIC）。MIC 是金属表面、非生物腐蚀产物和微生物细胞相互作用的结果，会导致金属 - 溶液界面的电化学发生局部变化。

不同微生物群体及其代谢产物、酶都可能具有腐蚀活性。早期对厌氧条件下 MIC 的研究主要集中在硫酸盐还原菌（SRB），后来发现微生物氢消耗引起的钢的阴极去极化作用也与多种微生物有关，如 SRB、产甲烷古菌、产乙酸菌和硝酸盐还原菌等。但近期研究表明，只有具备细胞外电子转移（EET）能力的微生物，才能直接从金属铁摄取电子，刺激钢表面的阴极反应，从而增强铁的腐蚀。

铁的腐蚀与 pH 值密切相关，pH 值高于 9.0 时，铁的腐蚀会因亚铁钝化膜的形成而受到抑制。在碱性厌氧环境中，存在多种嗜碱微生物，它们可能对金属腐蚀产生影响。然而，目前关于碱性条件下 MIC 的研究还很有限。本研究旨在探讨厌氧嗜碱细菌 Geoalkalibacter ferrihydriticus 在 pH 9.5 的碳酸盐 - 碳酸氢盐缓冲介质中，自养生长时诱导钢丝腐蚀的能力。

材料与方法

1. 实验菌株与材料：实验使用从苏打湖底沉积物中分离的嗜碱铁循环细菌 Geoalkalibacter ferrihydriticus Z - 0531^T，并以钢丝海绵作为腐蚀试样。实验前对钢丝进行 X 射线衍射（XRD）、X 射线荧光（XRF）和穆斯堡尔光谱（MS）分析，以确定其初始状态，并通过超声清洗去除可能的有机杂质。
2. 培养条件：实验采用厌氧培养基，其成分包括多种盐类、酵母提取物和微量元素溶液，灭菌后 pH 值为 9.5。培养基分装在不同规格的玻璃烧瓶中，加入钢丝后进行灭菌处理。
3. 腐蚀试验：将 Geoalkalibacter ferrihydriticus 在含有合成水铁矿和甲酸盐的培养基中培养，待其定殖在矿物表面后，取培养上清液作为接种物（5 vol %）接种到含有钢丝海绵的培养基中。设置多个实验组和对照组，包括无菌厌氧、无菌需氧、含铂丝的模拟电化学腐蚀以及添加合成磁铁矿或硫化钠的对照组。各实验组和对照组均进行三次重复实验，接种后的烧瓶在 35°C 下孵育不同时间。
4. 分析方法：实验过程中监测 H₂和乙酸盐的浓度，实验结束后，通过定量 PCR（q - PCR）分析 Geoalkalibacter ferrihydriticus 的细胞产量，利用 XRD、MS 和扫描电子显微镜（SEM）分析钢丝和固体沉淀物，通过激光共聚焦显微镜观察钢丝表面的生物膜。同时，采用气相色谱法分析气相中的分子氢含量，通过离心和酸化处理后用气相色谱法测定挥发性脂肪酸。
5. DNA 提取和 q - PCR 分析：设计针对 Geoalkalibacter ferrihydriticus 16S rRNA 基因的引物，使用 FastDNA Spin Kit for Soil 试剂盒提取培养物中的 DNA，以铁水矿生长的 Geoalkalibacter ferrihydriticus 培养物的基因组 DNA 作为校准曲线，通过直接细胞计数确定校准曲线的细胞含量，所有反应均进行三次重复。
6. 基因组分析：从 DOE JGI IMG 数据库检索 Geoalkalibacter ferrihydriticus 的基因组，使用 FeGenie 工具和手动筛选参与铁代谢的基因，包括多血红素细胞色素、相关孔蛋白和菌毛蛋白的基因，同时手动筛选基因组中的氢化酶基因。
7. 热力学计算：根据标准条件计算阳极和阴极反应的标准吉布斯自由能变化，进而计算标准电极电位，再利用能斯特方程确定实验条件下的电极电位。

实验结果

1. 钢丝成分：XRF 和 XRD 分析表明，钢丝是 α - Fe 和 Mn 的固溶体，化学式近似为 Fe_0.98Mn_0.02，初始钢丝中不含铁矿物杂质。穆斯堡尔光谱显示，初始钢丝的光谱由两个塞曼六重峰组成，分别对应不同环境的铁原子。
2. 无菌对照：在厌氧、需氧无菌对照以及添加合成磁铁矿的对照组中，钢丝的颜色和结构未发生明显变化，气相分析显示 H₂含量较低且波动较小。而含铂丝的对照组出现强烈的腐蚀过程，钢丝变黑，底部有红褐色沉淀，H₂含量较高。添加硫化钠的对照组中，钢丝在灭菌后立即变黑，且整个孵育期未发生变化。
3. Geoalkalibacter ferrihydriticus 与钢丝的作用
   • 首次转接培养：在首次转接培养中，Geoalkalibacter ferrihydriticus 细胞数量在整个孵育期未超过 5 × 10⁵ cells/mL，但钢丝颜色逐渐变黑，表面覆盖气泡并上浮，底部形成蓝绿色沉淀，唯一可检测到的代谢产物是 H₂，其浓度在实验结束时达到 6.2 mM。激光共聚焦显微镜显示钢丝表面被微生物细胞几乎完全覆盖，形成多层生物膜。实验结束时，钢丝海绵最大失重为 21%，穆斯堡尔光谱和 XRD 分析表明，形成了绿色锈和菱铁矿等含铁矿物。
   • 稳定的铁腐蚀培养物：在后续三次转接培养中，腐蚀速率减慢，但细胞产量和分子氢的最终产量保持稳定。每次转接培养后，钢丝海绵均上浮并变黑，底部形成蓝绿色矿物沉淀。q - PCR 分析显示细胞数量未超过 4 × 10⁶ cell/mL，SEM 分析表明各次转接培养中钢丝表面结构和矿物沉淀特征相似，均有强烈腐蚀和绿色锈晶体形成，穆斯堡尔光谱分析显示生物转化后的钢丝样品和新形成的沉淀具有相似的光谱特征。
   • 添加合成磁铁矿或硫化钠的对照实验：添加合成磁铁矿略微增加了细菌生长初期的氢气产生速率，但最终氢气浓度未超过未添加磁铁矿的培养物。添加硫化钠则完全抑制了 Geoalkalibacter ferrihydriticus 的生长，其氢气浓度、钢丝表面结构变化和矿物沉淀特征与未添加硫化钠的无菌对照相似。
   
   
4. Geoalkalibacter ferrihydriticus 的基因组分析：基因组分析共鉴定出 42 个可能决定 EET 过程的基因，包括多种多血红素细胞色素、“长” 型 IV 菌毛和细胞色素 b 含醌氧化酶复合物的基因。同时，发现了四个编码假定的产氢 [NiFe] 氢化酶的基因簇，这些氢化酶可能参与质子还原产氢过程。
5. 热力学计算结果：热力学计算表明，以质子为电子受体，将 Fe⁰氧化为绿色锈或菱铁矿的过程在热力学上是有利的，能够支持 Geoalkalibacter ferrihydriticus 的生长。计算得到的标准吉布斯自由能变化和电极电位显示，在实验条件下，这些反应可以自发进行。

讨论

在缺氧环境中，微生物诱导的腐蚀可由不同微生物群体介导，微生物从 Fe⁰直接摄取电子是 MIC 的主要原因之一，即电 MIC（EMIC）。在碱性环境中，存在能够诱导 EMIC 的微生物，这可能影响一些关键的经济活动，如核废料储存和油气管道运输等。但目前尚未有在高 pH 下执行 EMIC 的特定微生物报道。

选择 Geoalkalibacter ferrihydriticus 进行研究，是因为它在厌氧生长过程中能够实现不溶性铁矿物或电极的还原和氧化，可促进阴极去极化或直接从 Fe⁰获取电子。实验结果表明，Geoalkalibacter ferrihydriticus 能够促进钢丝的腐蚀，伴随 H₂气体的形成和 Fe⁰氧化产物的积累。通过计算穆斯堡尔数据的总化学计量参数，确定了不同培养阶段绿色锈的主要矿物成分，首次转接培养中主要是 fougèreite，后续转接培养中可能是 trébeurdenite 和 m?ssbauerite 的混合物。

实验中腐蚀过程的速率和强度以及氢气产量在生长培养物中明显高于无菌对照（除含铂丝对照外）。添加硫化钠抑制了 Geoalkalibacter ferrihydriticus 的生长，而添加合成磁铁矿则有刺激作用，这表明该微生物通过 EET 机制利用金属铁作为电子供体。SEM 未观察到明显的细胞结构，但荧光共聚焦显微镜显示存在生物膜，q - PCR 分析表明细胞数量增加。

关于微生物生长的化学支持反应存在两种可能：氢营养型还原电化学产生的 Fe (III) 或直接代谢氧化 Fe⁰并以质子为电子受体。实验中仅在首次转接培养中观察到菱铁矿的形成，且整个培养过程中 H₂浓度持续增加，这表明 Geoalkalibacter ferrihydriticus 更可能通过直接向内 EET 机制利用 Fe⁰作为电子供体，产生含菱铁矿杂质的绿色锈。基因组分析揭示了厌氧铁氧化的决定因素，但仍需进一步的转录组和蛋白质组学研究来评估其 Fe (II) 氧化机制。

基于实验数据和热力学计算，提出了 Geoalkalibacter ferrihydriticus 与钢丝相互作用的机制。在实验条件下，该微生物类似含铂丝对照中的铂，作为腐蚀过程的催化剂，伴随绿色锈和氢气的产生。为实现这一过程，微生物需要利用质子还原、能量守恒的膜结合氢化酶，将放能电子转移与化学渗透梯度的建立相耦合。虽然相关机制还需进一步生化评估，但研究结果表明，在规划地下核废料处置时，应考虑这种微生物诱导的腐蚀过程。

结论

本实验表明，碱性厌氧条件下的 MIC 过程与中性条件下同样重要，且可由自养微生物增强。Geoalkalibacter ferrihydriticus 在自养条件下与钢丝积极相互作用，通过 EET 机制直接氧化金属铁，最可能的无机电子受体是水的质子。这与之前描述的需要有机电子受体的铁腐蚀机制不同。

对 Geoalkalibacter ferrihydriticus 的综合基因组分析揭示了厌氧铁腐蚀与产氢相关的决定因素，即 Mto 样电子摄取孔蛋白 - 细胞色素复合物和假定的产 H₂膜结合氢化酶的基因。Geoalkalibacter ferrihydriticus 诱导的腐蚀主要产物是绿色锈，尽管其钝化膜有抑制作用，但腐蚀过程稳定且强度高于无菌对照。这表明厌氧嗜碱微生物在无有机底物或有机电子受体时也能有效催化钢的腐蚀，在地下核废料处置规划中应予以考虑。