四川龙门山土壤微生物群落：深度与空间的探秘之旅

《Applied and Environmental Microbiology》：Soil depth exerts greater effect on bacterial community than spatial structure in Longmenshan fault zone

这篇研究聚焦四川龙门山断层带土壤微生物群落，分析不同土层细菌多样性及与环境特征关系。发现土壤深度对细菌群落组成和网络特性影响大于空间距离，不同土层关键物种有别，为探究微生物功能和维护土壤健康提供依据。

　　### 研究背景
山地生态系统是陆地系统的重要组成部分，能提供众多生态服务。其气候、植被和土壤特性在短距离和海拔梯度上变化大，这些变化会影响土壤微生物群落结构和功能。微生物在山地生态系统的生物地球化学循环、物质和能量转化以及维持生态系统稳定性方面发挥关键作用，因此研究山地生态系统中微生物群落结构的驱动因素至关重要。

土壤微生物多样性和群落与土壤特性密切相关，土壤特性的变化会导致不同的生态过程和环境筛选程度，进而造成微生物群落的差异。例如，长白山表层土壤中，pH 是影响细菌多样性的主要因素，而深层土壤中碳有效性起主要作用；还有研究表明土壤有机碳（SOC）含量影响表层土壤微生物多样性，深层土壤微生物则受碳组分影响，且深层土壤微生物群落更稳定。

在全球尺度上，土壤微生物群落受空间结构异质性的强烈影响，但在区域尺度上，空间结构对土壤微生物群落变化的相对贡献尚不清楚。一些研究认为土壤特性比地理距离和气候因素对细菌群落变化的影响更大，也有研究发现土壤微生物群落组成与空间结构无关。而且目前对空间因素是否影响深层土壤细菌群落的了解有限，因此在小尺度上研究影响土壤微生物群落结构变异性的因素很有价值。

本研究分析了龙门山断层带北部山区 5 个采样点 15 个样地的细菌多样性，以及群落结构与环境特征的关系。研究假设为：由于气候变异小和植被一致，小尺度上不同地点的表层土壤细菌多样性差异不显著；由于环境和资源竞争或扩散屏障变异性的相互作用，不同土层的土壤细菌群落受不同因素驱动；不同土层的细菌网络不同，关键物种也不同。

材料与方法

• 研究地点：研究在四川省绵阳市进行（31°15′50″–32°14′16″N，104°30′28″–105°28′51″E），该地区位于四川盆地与川西高原的自然边界北部，也是青藏高原边缘的地震活动带，属于亚热带湿润季风气候，年平均气温 14.7°C - 17.3°C，年降水量 825.8 - 1417mm，优势植被类型有柏木（Cupressus funebris Endl.）、桤木（Alnus cremastogyne Burkill）、刺槐（Robinia pseudoacacia L.）、槲树（Quercus aliena Blum）、沼生栎（Quercus palustris Münchh.）和白茅（Imperata cylindrica (L.) P. Beauv.）。
• 实验设计与采样：2022 年春季采样，在研究区域选择 5 个采样点，每个采样点随机选取 3 个 10×10m 的样地。每个样地设置 3 个 50cm 深的剖面，在每个剖面的 0 - 5cm、5 - 25cm 和 25 - 50cm 深度采集土壤样本，分别标记为 T、M 和 S。将采样点的土壤样本混合均匀，共采集 45 个混合样本，然后将混合样本分为三份，分别用于扩增子测序（?80°C 保存）、微生物生物量碳（MBC）测定（4°C 保存）和土壤理化性质分析（室内风干）。
• 土壤特性测定：SOC 采用重铬酸钾氧化法测定；易氧化有机碳（ROC）含量用 KMnO₄氧化法测定；土壤含水量（SWC）通过将样品在 105°C 烘箱中烘干测定，pH 用 pH 计（水土比 2.5:1）测量；冷水可提取有机碳（CEOC）和热水可提取有机碳（HEOC）用 1:4 的混合物（土水比）提取；MBC 采用氯仿熏蒸法测定；土壤铵态氮（NH₄⁺）和硝态氮（NO₃^?）用比色法测定 。
• 土壤 DNA 提取和 Illumina 测序：用 FastDNA Spin Kit（MP Biomedicals，美国加利福尼亚州圣安娜）从土壤中提取 DNA。使用引物 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG - 3′）和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT - 3′）扩增 16S rRNA 基因的 V3 - V4 高变区。通过热循环 PCR 系统进行 16S rRNA 基因的 PCR 扩增，PCR 产物用 Agencourt AMPure Beads（贝克曼库尔特，美国印第安纳波利斯）和 PicoGreen dsDNA 检测试剂盒（赛默飞世尔科技，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）进一步纯化和定量，最后在中国深圳华大基因科技有限公司进行测序。
• 统计分析：所有数据以平均值 ± 标准差表示，对数据进行对数转换以满足参数检验的假设。采用双向嵌套方差分析（ANOVA）分析不同地点和土层对土壤特性和细菌群落的影响。运用非参数多元统计检验（相似性分析 [ANOSIM] 和置换多元方差分析 [ADONIS]）和非度量多维尺度分析（NMDS）来识别不同土壤地点和土层的细菌群落差异。进行 Spearman 秩相关分析和逐步多元回归，研究土壤特性对细菌群落的影响。使用 Bray - Curtis 和欧几里得距离在部分 Mantle 检验中分析细菌群落的分类距离。

采用非随机共现网络方法阐明不同土层和地点的细菌相互作用，相关系数限制在大于 0.7 或小于 - 0.7（P <0.05），用 Gephi 0.9.7 软件和 Fruchterman Reingold 布局进行可视化，利用 “igraph” 包获取子网络拓扑网络属性，用 Song 等人提出的方法定义网络节点，计算 Zi 和 Pi 值，用双向 ANOVA 确定地点和土层对网络拓扑属性的影响，计算 Spearman 相关系数评估网络属性与环境参数的关系以及不同生物地理参数对共现网络参数的影响。

利用约束冗余分析（RDA）研究土壤因子与细菌群落的关系，使用 “Vegan” 包进行变异分解分析，将环境因子分为两类：土壤因子（本文测量的土壤特性）和空间结构（参考文献 [5,33] 计算）。

研究结果

• 土壤特性的变化：研究发现，地点和土层对土壤特性有显著影响。地点对 pH、SWC、SOC、ROC、溶解性有机碳（DOC）、NO₃^?、NH₄⁺、HEOC、CEOC 和 MBC 有明显影响；土层除 pH 值外，对其他土壤特性均有显著影响。SWC、SOC、MBC 和 NO₃^?随土壤深度增加而减少，表层土壤中 SOC、NH₄⁺和 MBC 含量平均比深层土壤分别高 26.72g/kg、11.06mg/kg 和 250.63mg/kg，深层土壤 MBC 含量比表层减少超过 50%，且这些土壤特性在不同地点呈现不同的变化模式。
• 细菌 α - 多样性和群落组成：从 45 个土壤样本的 16S rRNA 基因序列中获得 2,648,380 条有效序列，在 97% 相似性水平下聚类为 62,613 个操作分类单元（OTUs），属于 39 个门、103 个纲和 927 个属。研究应用细菌群落丰富度（Chao1 和 ACE 指数）和多样性（Shannon 和 Simpson 指数）作为细菌 α - 多样性的指标，结果显示土壤细菌群落多样性随土壤深度增加而降低，土层对 Chao1 和 ACE 指数等 α - 多样性指标有显著影响，而地点对 α - 多样性影响不显著。

优势细菌类群在不同土层均为 α - 变形菌纲（α - Proteobacteria）、γ - 变形菌纲（γ - Proteobacteria）和邻近杆菌纲（Vicinamibacteria）（相对丰度 > 5%），它们在不同地点共占约 40%，说明土壤细菌群落主要由变形菌门（Proteobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria）组成。基于 Bray - Curtis 距离的 NMDS 分析显示不同土层细菌群落存在明显差异，置换多元方差分析（PerMANOVA）进一步证实不同地点和土层的细菌组成存在明显偏差，地点和土层对芽单胞菌纲（Gemmatimonadetes）、芽囊杆菌纲（Blastocatellia）、浮霉菌纲（Planctomycetes）和 α - Proteobacteria 的相对丰度都有重要影响。

• 环境变量对细菌 α - 多样性和群落的影响：不同土层中，细菌多样性指数与土壤因子的相关性不同。在 T 层，Simpson 指数与 SWC 呈正相关，Chao1 指数与 SWC 呈负相关，Shannon 指数与 NO₃^?呈负相关；在 M 层，Chao1、ACE 和 Shannon 指数与 DOC 相关性最强，且 Shannon 指数与 pH 呈正相关；在 S 层，Chao1、ACE 和 Shannon 指数与 ROC 和 CEOC 呈正相关。

多元逐步线性回归结果表明，T 层中 SWC 是影响 Shannon 指数（34.4%）和 Simpson 指数（33.6%）的主要因素；M 层中 ROC 是影响细菌 Simpson（40.1%）和 Chao1（43.9%）指数变化的主要变量，DOC 是影响 Shannon 指数（34.0%）的主要因素；S 层中 SOC 是影响 Shannon 指数（34.4%）和 Simpson 指数（33.6%）的主要因素。总体而言，SWC 对 T 层细菌多样性变化贡献最大，而 SOC 及其组分是 M 层和 S 层细菌丰富度和多样性变化的主要变量。

土壤特性对细菌群落的影响在不同土层也有所不同。T 层中，SWC、pH、MBC 和 NO₃^?是影响细菌群落变化的最重要因素；M 层中，SOC 和 ROC 最为重要；S 层中，SOC 是最重要的因素。RDA 结果显示，土壤因子能区分不同土层的土壤细菌群落，不同土层中影响细菌群落的主要土壤因子不同。

• 网络共现模型：网络分析发现，土壤细菌群落的共生网络在不同地点和土层的拓扑属性存在明显差异。0 - 5cm 土壤网络有 1,769 条边，其中正相关边 1,341 条（75.81%），负相关边 428 条（24.19%）；5 - 25cm 土壤网络有 2,371 条正相关边（98.30%）和 41 条负相关边（1.70%）；25 - 50cm 土壤网络有 2,616 条正相关边（98.38%）和 43 条负相关边（1.62%）。不同土层的节点数、平均路径长度、网络直径和聚类系数也存在显著差异，且土壤网络的拓扑特征与环境变量的相关性在不同土层有所不同。

通过 Zi - Pi 关系分析对生态网络的关键分类单元进行节点分类，发现所有节点主要分为外围节点、模块枢纽、网络枢纽和连接节点四类，其中大部分为三个土层的外围节点。模块枢纽和网络枢纽通常被视为关键物种，但研究区域所有土层网络中均未发现网络枢纽，只识别出多个模块枢纽，不同土层的关键物种主要属于不同的分类单元。

• 变异分解：空间因素解释了不同土层细菌群落的部分变异，且随着土壤深度增加，空间因素对细菌群落变异的解释力逐渐降低。T 层中，细菌群落总可解释变异为 38%，土壤和空间因素分别解释 23% 和 7%，两者共同解释 8%；M 层中，总可解释变异为 41%，土壤和空间因素分别解释 34% 和 4%；S 层中，总可解释变异为 21%，土壤和空间因素分别解释 13% 和 6%。

讨论

• 不同土层细菌多样性和群落组成：研究结果表明，龙门山北部山区同一土层内土壤细菌 α - 多样性和群落结构存在显著差异，不支持第一个假设。土壤细菌多样性一般随土壤深度增加而降低，可能是因为土壤养分（如 C、N、P）随深度减少，影响了土壤微生物多样性。虽然研究区域尺度小，但细菌群落仍因地点和土层不同而有很大差异，优势细菌类群在不同土层的相对丰度不同，且与土壤养分存在相关性。不同土层的优势细菌门为 Proteobacteria 和 Acidobacteria，可能是因为它们适应性强，能在多种环境中生存。细菌多样性指数随土壤深度的变化趋势与以往研究结果一致，但多样性指数随土壤深度变化不显著，可能与采样点植被类型和多样性一致有关。
• 不同土层细菌群落的驱动因素：土壤特性是土壤微生物群落的关键决定因素。表层土壤细菌群落组成主要与 SWC 和 pH 相关，而深层土壤与 SOC 及其组分相关。pH 和 SWC 可能通过影响环境因素（如养分有效性和有机碳含量）来影响表层土壤细菌群落结构，也可能通过影响植被和土壤动物间接影响土壤微生物群落。深层土壤中，SOC 及其组分是驱动细菌多样性和群落结构变化的主要因素，这可能与深层土壤缺氧，微生物厌氧生长有关，且碳底物有效性可能限制了一些物种的生态位。此外，不同土层中部分细菌类群与 SWC 的相关性不同，说明土壤微生物多样性和群落结构变化受不同土壤特性驱动，证实了研究假设。
• 不同土层细菌网络属性和关键物种：网络分析发现，表层土壤网络的节点数、平均路径长度和网络直径大于深层土壤，且随着土壤深度增加，正相关边数量远大于负相关边数量，表明细菌群落的共生关系更明显，对环境因素变化的影响更大。深层土壤网络比表层土壤网络更复杂，但与土壤变量的相关性更低。不同土层的细菌共生网络和拓扑结构受土层影响比地点更大，可能是因为研究区域尺度小，不同地点养分含量变化小于不同土层深度的变化。

研究还发现不同土层共现网络的关键节点不同，表层土壤主要关键物种包括 Methylomirabilota 门的 Rokubacteriales 属、Acidobacteriota 门的 Vicinamibacteria 纲和 Acidobacteriota 门的 Vicinamibacteria 属；M 层主要包括 Proteobacteria 门的 Elsterales 目和 Bacteroidota 门的 Chryseobacterium 属；深层土壤没有关键物种。这进一步证明了不同土层细菌类群的生态位分化，但这些关键物种的具体生态作用仍不清楚，后续研究其在生态系统中的作用对土壤健康研究至关重要。

• 土壤和空间因素对不同土层细菌群落的相对贡献：土壤特性和空间因素都是导致不同土层细菌群落变化的重要因素，但土壤特性对细菌群落的贡献更大，证实了研究假设。不同研究结果存在差异，可能是因为研究对象不同，本研究选择山地土壤，而其他研究选择高原湿地等。研究还发现，由于细菌对环境因素的反应不同，在短距离内土壤中的细菌也会表现出不同的代谢分离和资源偏好。但本研究区域较小，样本量相对较少，可能影响结果的可靠性，未来增加样本量可更好地探究小区域尺度土壤微生物群落的空间分布特征及其驱动因素。

结论

研究表明，pH 和 SWC 是影响表层土壤细菌多样性和群落结构的关键因素，表层土壤细菌多样性与 pH 呈显著正相关，与 SWC 呈负相关。不同土层的细菌网络差异显著，且随土壤环境变化的响应不同。土壤深度对土壤细菌群落的影响明显大于空间因素，环境因素（解释 13% - 34% 的变异）和空间因素（解释 4% - 7% 的变异）共同解释了大部分细菌群落变异，说明土壤因素是微生物群落变化的主要驱动因素，但空间因素也不可忽视。研究还揭示了不同土层细菌群落的关键物种，体现了山地生态系统中微生物对环境变化的差异和复杂响应。未来研究应关注生态系统中的关键分类单元及其功能，这对维持土壤质量和农产品质量具有重要意义。