揭示噬纤维菌独特纤维素利用机制：chu1279基因编码蛋白的关键作用

《Applied and Environmental Microbiology》：SGBP-B-like bimodular cellulose-binding protein CHU_1279 is essential for cellulose utilization by Cytophaga hutchinsonii

本文聚焦噬纤维菌（Cytophaga hutchinsonii）独特的纤维素利用策略。研究发现 chu1279基因编码的外膜蛋白 CHU_1279 对其利用纤维素至关重要，为解析该菌及相似细菌的纤维素利用机制提供关键线索，助力拓展对非典型多糖利用位点（PUL）的认知。

　　

引言

纤维素作为地球上储量最丰富的可再生多糖，在生物转化领域极具应用潜力。自然界中，微生物降解纤维素的策略主要有两种：部分丝状真菌和需氧细菌分泌胞外游离纤维素酶；厌氧细菌如热纤梭菌（Clostridium thermocellum）形成细胞表面锚定的多蛋白复合体 —— 纤维小体。然而，噬纤维菌（Cytophaga hutchinsonii）属于拟杆菌门，它既不分泌游离纤维素酶，也不形成纤维小体，而是以底物接触依赖的方式消化结晶纤维素，其独特的纤维素利用策略至今尚未完全明晰。

拟杆菌门的多数成员能够高效降解复杂多糖，这主要得益于它们采用的 SusC 样系统。该系统由多糖利用位点（PUL）编码，定位在细胞表面，可协同捕获、降解和转运目标碳水化合物。典型的 PUL 包含至少一对编码核心外膜 TonB 依赖转运体（TBDT）和紧密相关的细胞表面聚糖结合蛋白 A（SGBP-A）的基因，以及一个或多个额外的非同源 SGBP（如 SGBP-B）。尽管 SGBP 在多糖利用中发挥重要作用，但目前对其的研究主要集中在参与（半）可溶性聚糖利用的 PUL，涉及结晶纤维素利用的 SGBP 尚未被鉴定和功能表征。

此前研究表明，噬纤维菌的 chu₁₂₇₆-chu₁₂₈₀基因簇可能参与纤维素利用过程，但该基因簇中的 chu₁₂₇₈和 chu₁₂₇₉编码的假设蛋白功能尚不明确。本研究旨在探究 chu₁₂₇₉在噬纤维菌利用纤维素过程中的功能。

结果

1. chu₁₂₇₉缺失抑制噬纤维菌对纤维素的利用：通过蛋白质印迹和细胞分级分离分析，确定 CHU_1279 定位于噬纤维菌的外膜。构建 chu₁₂₇₉缺失突变体?chu₁₂₇₉，在以葡萄糖为唯一碳源时，其生长与野生型菌株无异；但在以微晶纤维素（Avicel）或滤纸为碳源时，?chu₁₂₇₉无法生长，不过其对滤纸仍具有显著的黏附能力，且细胞相关的内切葡聚糖酶和 β- 葡萄糖苷酶活性略有下降。将 chu₁₂₇₇-chu₁₂₇₉及上游序列导入?chu₁₂₇₉进行互补实验，结果显示互补菌株 Cp?chu₁₂₇₉能够在纤维素上生长，而仅导入 chu₁₂₇₇-chu₁₂₇₈的对照菌株 C77-78-?chu₁₂₇₉则不能，表明外膜蛋白 CHU_1279 在噬纤维菌利用纤维素过程中起关键作用。
2. CHU_1279 由两个 CBM 样结构域组成且能结合纤维素：利用 Alpha Fold 2 预测 CHU_1279 的三维结构，发现它由两个 β- 三明治 CBM 样结构域通过无序连接子相连，整体结构与拟杆菌属（Bacteroides thetaiotaomicron）β(1,3)- 葡聚糖 PUL 中的 SGBP-B 的 CBM 样结构域串联相似。从大肠杆菌（E. coli）中异源表达并纯化去除信号肽且带有 6*His 标签的 CHU_1279，圆二色谱分析证实其具有 β- 三明治折叠结构。结合实验表明，CHU_1279 对 Avicel 微晶纤维素和磷酸膨胀纤维素（PASC）均有显著的结合能力。
3. CHU_1279 的 C 末端结构域对纤维素结合和噬纤维菌利用纤维素至关重要：分别表达并纯化 CHU_1279 的 N 端 CBM 样结构域（N-CBML）和 C 端 CBM 样结构域（C-CBML），并进行纤维素结合实验。结果显示，C-CBML 能够显著结合纤维素，而 N-CBML 几乎没有结合能力。通过计算平衡结合常数（K_d）和最大结合量（B_max），发现 C-CBML 与全长 CHU_1279 的结合能力相似，但结合亲和力略低。将 N-CBML 和 C-CBML 分别在?chu₁₂₇₉中表达，发现表达 C-CBML 的菌株能够在纤维素上生长，而表达 N-CBML 的菌株则不能，表明 C-CBML 是 CHU_1279 在纤维素利用中起主要作用的结构域。
4. 鉴定 CHU_1279 结合纤维素的关键氨基酸：通过序列比对，发现 CHU_1279 有 6 个与木聚糖酶 Xyn10C 中参与配体结合的芳香族氨基酸残基相似的位点。对这 6 个位点进行定点突变，将每个残基替换为丙氨酸（Ala），并测定突变体的体外纤维素结合能力。结果表明，色氨酸 89（Trp89）、苯丙氨酸 92（Phe92）和苯丙氨酸 180（Phe180）对纤维素结合作用可忽略不计，而苯丙氨酸 256（Phe256）、酪氨酸 253（Tyr253）和苯丙氨酸 343（Phe343）的突变显著降低了 CHU_1279 对纤维素的结合能力。圆二色谱分析显示，这些突变对 CHU_1279 的整体结构影响较小，说明 Tyr253、Phe256 和 Phe343 是 CHU_1279 结合纤维素的关键氨基酸。
5. CHU_1279 在噬纤维菌利用纤维素中的关键作用不止于其结合能力：将 CHU_1279 的突变体 Y253A、F256A、F343A 以及三突变体 Y253A-F256A-F343A 分别在?chu₁₂₇₉中表达，发现这些突变体菌株在 Avicel 纤维素上的生长情况与表达野生型 CHU_1279 的互补菌株相似。扫描电镜分析显示，表达三突变体的菌株与表达野生型 CHU_1279 的菌株对滤纸的黏附模式相似，表明 CHU_1279 的物理存在比其碳水化合物结合能力对纤维素利用更为关键。
6. 非典型 PUL 也存在于与噬纤维菌密切相关的另外两种纤维素分解拟杆菌中：在与噬纤维菌密切相关的橙色噬纤维菌（C. aurantiaca）和粘球菌状孢囊杆菌（Sporocytophaga myxococcoides）中进行全基因组搜索，发现它们均含有 CHU_1279 的同源基因，且重组蛋白具有显著的纤维素结合能力。进一步分析侧翼基因组序列，发现这两种细菌中也存在与 chu₁₂₇₆-chu₁₂₇₈类似的基因簇。

讨论

噬纤维菌作为土壤中常见的纤维素降解菌，其独特的纤维素利用策略一直备受关注。此前研究认为 PUL 在噬纤维菌的纤维素消化过程中不起作用，但本研究表明 chu₁₂₇₆-chu₁₂₈₀基因簇可能编码一种新型的 PUL 系统。其中，CHU_1276 和 CHU_1277 编码的外膜蛋白对纤维素利用很重要，CHU_1280 编码的内切葡聚糖酶参与纤维素降解，这些都符合 PUL 系统的特征。

结构预测显示 CHU_1279 与 SGBP-B 的 CBM 样结构域串联相似，且具有外膜定位和纤维素结合能力，推测其为 SGBP-B 样蛋白。CHU_1278 的结构也暗示它可能是 PUL 系统中的另一个 SGBP，但由于其在大肠杆菌中异源表达未获得可溶性活性重组蛋白，暂无法进一步表征。

虽然 CHU_1279 有两个 CBM 样结构域，但 C-CBML 结构域在纤维素结合中起主要作用，N-CBML 结构域虽不直接结合纤维素，但可能有助于维持 CHU_1279 的功能，增加其蛋白灵活性，促进纤维素捕获。在典型的 PUL 系统中，SGBP-A 对聚糖利用至关重要，而在 chu₁₂₇₆-chu₁₂₈₀基因簇中，缺乏 SGBP-A 同源物，SGBP-B 样的 CHU_1279 对纤维素利用不可或缺。研究还发现，CHU_1279 的物理存在对纤维素同化更为关键，它可能有助于稳定 PUL 系统的其他组件，或参与更大复合物的组装。此外，CHU_1279 的缺失会影响噬纤维菌在低浓度葡萄糖上的生长，且可能与 CHU_1278 协同作用，促进纤维素链或中间寡糖的锚定和同化，具体机制仍需进一步研究。

材料和方法

1. 细菌菌株和培养条件：以噬纤维菌 ATCC 33406 为野生型菌株，在含有不同碳源的 PY10 培养基中于 28°C、200 rpm 振荡培养；大肠杆菌 DH5α 在 LB 培养基中 37°C 培养，必要时添加抗生素。
2. 构建?chu₁₂₇₉和 Cp?chu₁₂₇₉：通过扩增 chu₁₂₇₉基因上下游序列并连接到质粒 pYT313，转化入噬纤维菌野生型细胞，经 SacB 筛选获得?chu₁₂₇₉；扩增 chu₁₂₇₇-chu₁₂₇₉及上游序列连接到 pCH03C，转化入?chu₁₂₇₉构建 Cp?chu₁₂₇₉，同时构建对照菌株 C77-78-?chu₁₂₇₉。
3. 构建表达 CHU_1279 变体的噬纤维菌菌株：通过 PCR 扩增相应片段并连接到 pCH03C，构建表达 N-CBML、C-CBML 以及 CHU_1279 定点突变体的质粒，转化入?chu₁₂₇₉获得相应突变菌株。
4. 不同碳源的生长分析：将噬纤维菌在含葡萄糖的 PY10 培养基中预培养，收集细胞后转移至含不同碳源的新鲜培养基中。以葡萄糖为碳源时，通过测定 OD₆₀₀监测生长；以结晶纤维素为碳源时，测定总蛋白含量反映生长情况；以滤纸为碳源时，将细胞接种在含滤纸的 PY10 平板上培养观察。
5. 分析 CHU_1279 在噬纤维菌中的亚细胞定位：分别制备噬纤维菌的总膜蛋白、细胞内可溶性蛋白和外膜蛋白，进行 SDS-PAGE 和蛋白质印迹分析，使用针对 CHU_1279 的多克隆抗体检测其亚细胞定位。
6. 酶活性测定：培养噬纤维菌至对数中期，收集细胞测定内切葡聚糖酶和 β- 葡萄糖苷酶活性，以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）和对硝基苯 β-D - 吡喃葡萄糖苷（pNPG）为底物，同时测定总蛋白浓度，计算比活性。
7. CHU_1279 及其变体在大肠杆菌中的异源表达和纯化：扩增 chu₁₂₇₉及其变体、N-CBML、C-CBML 以及橙色噬纤维菌和粘球菌状孢囊杆菌中 CHU_1279 同源物的编码序列，构建表达质粒转化入大肠杆菌 BL21 (DE3)，诱导表达后通过亲和层析纯化重组蛋白。
8. 纤维素结合实验：以 Avicel 微晶纤维素和 PASC 为底物，将蛋白与底物孵育，离心收集沉淀和上清，洗涤沉淀后进行 SDS-PAGE 分析，检测蛋白结合情况。
9. 测定解离常数的吸附等温线：测定全长 CHU_1279 和 C-CBML 与 Avicel 纤维素的平衡结合常数（K_d）和结合容量（B_max），将蛋白与不同浓度的 Avicel 纤维素混合孵育，离心后测定上清蛋白浓度，通过非线性回归拟合方程计算相关参数。
10. 电子显微镜分析：将噬纤维菌细胞接种在滤纸上培养，固定、脱水、镀膜后用扫描电子显微镜观察细胞对滤纸的黏附情况。
11. 圆二色谱分析：使用 Jasco J-810 光谱仪测定 CHU_1279 及其变体的圆二色谱，分析其二级结构。
12. 序列分析：从 KEGG 数据库获取 chu₁₂₇₇-chu₁₂₇₉核苷酸序列，从 NCBI 数据库获取 CHU_1279 同源物序列，从 JGI 数据库获取橙色噬纤维菌和粘球菌状孢囊杆菌的基因组序列。使用 ClustalW 进行氨基酸序列比对，SignalP 预测信号肽，AlphaFold Protein Structure Database 获取蛋白预测结构，HHpred 进行蛋白序列分析。

致谢

感谢 Dr. MJ McBride 提供噬纤维菌 ATCC 33406 菌株和质粒 pYT313，感谢山东大学微生物技术国家重点实验室生命与环境科学核心设施的 Wang Sen 在扫描电镜分析方面的帮助。本研究得到山东省重点研发计划、国家自然科学基金以及盐碱地综合利用国家技术创新中心项目的资助。