探秘巴西固氮螺菌：IAA 生物合成途径维持膜电位稳态的关键作用

本文聚焦巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense），发现吲哚 - 3 - 乙酸（IAA）生物合成途径在维持其膜电位稳态和调节翻译中起关键作用，揭示 IAA 可保护细菌免受吲哚衍生物毒性影响，为理解土壤细菌生理提供新视角。

　　

引言

在微生物的奇妙世界里，吲哚类化合物有着独特的地位。它由多种细菌产生，比如大肠杆菌（Escherichia coli）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）等。吲哚可作为信号分子，参与细菌众多生理过程的调控，像离子运输、细胞质 pH 稳态维持等。但高浓度的吲哚会像捣乱分子一样，抑制细胞分裂，影响细菌的正常生长。

吲哚 - 3 - 乙酸（IAA）也是细菌、植物和真菌都能合成的吲哚衍生物。在植物中，它被称为生长素（auxin），对植物生长发育起着至关重要的调节作用。在细菌领域，IAA 同样表现出色，能介导基因表达变化，参与细菌的应激反应、抗生素合成等过程。

巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）是一种能促进植物生长的细菌，它合成 IAA 的能力不容小觑。其 IAA 生物合成主要通过依赖色氨酸（tryptophan，Trp）的途径，其中吲哚 - 3 - 丙酮酸脱羧酶（indole - 3 - pyruvate decarboxylase，IpdC）是关键的限速酶。虽然 IAA 在巴西固氮螺菌与植物根系的相互作用中作用显著，但它在细菌自身生理方面的作用却一直是个谜。本研究就旨在揭开这个谜底，探索 IAA 生物合成在巴西固氮螺菌生理学中的潜在作用。

结果

1. IpdC 启动子的表达模式和 IAA 产生：研究人员首先对ipdC启动子在细菌生长不同阶段的表达模式展开研究。在以氯化铵为氮源的基本培养基中培养细菌时，发现添加 IAA 和 IAA 合成前体吲哚 - 3 - 丙酮酸（indole - 3 - pyruvic acid，I3P）都能显著诱导ipdC启动子活性，且在指数生长期的诱导作用比稳定期更明显。而添加色氨酸则对启动子活性没有影响。同时，与在氯化铵存在下生长相比，在固氮条件下（无化合态氮源且不曝气），ipdC启动子活性更高，并且随着时间推移，在氯化铵存在的情况下，启动子活性也会增加。这表明ipdC的诱导与氮代谢以及 IAA 生物合成前体 I3P 密切相关。
2. IpdC 敲除导致巴西固氮螺菌生长缺陷和细胞形态改变：为了深入了解 IAA 生物合成对细菌生理的影响，研究人员构建了 * A. brasilense ipdC::Gm^r* 插入突变体。在以氯化铵为氮源的基本培养基中，突变体的生长速率明显低于野生型菌株，其延迟期延长，进入稳定期的时间也推迟。通过对细胞体积的测量发现，突变体在指数期和稳定期的细胞体积都显著小于野生型。而且，突变体细胞的细胞膜在指数期用 FM4 - 64 染料染色时，效果不如野生型，这说明突变体的细胞膜生理状态发生了改变。

进一步研究发现，突变体在指数期的静息膜电位显著低于野生型，不过在稳定期两者没有差异。当用羰基氰化物间氯苯腙（carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP）处理使细胞膜去极化时，所有测试菌株的 DiSC3 (5) 荧光都下降，证实了该荧光探针可用于检测膜电位。将野生型ipdC基因转入突变体后，能恢复突变体在指数期的膜电位缺陷，这表明ipdC基因对维持膜电位起着重要作用。

此外，研究人员还用不同浓度的 HCl 处理野生型和突变体菌株，以测试它们维持膜电位稳态的能力。结果发现，野生型菌株的静息膜电位不受 HCl 浓度增加的影响，而突变体在部分 HCl 浓度下，静息电位会发生变化，这说明缺乏ipdC的菌株无法维持膜电位稳态。3. 吲哚 - 3 - 丙酮酸导致巴西固氮螺菌细胞膜去极化：为什么ipdC突变体的膜电位会降低呢？研究人员推测，由于突变体无法将 I3P 转化为 IAA，可能会导致 I3P 积累，而高浓度的 I3P 可能会使细胞膜去极化。实验结果证实了这一推测，当向野生型菌株中添加 I3P 时，细胞膜电位会以浓度依赖的方式去极化，而添加 IAA 和色氨酸则没有这种效果。而且，I3P 对膜电位的影响在细胞洗涤后会迅速消失，说明这种影响是可逆的。持续暴露于 I3P 24 小时，同样会导致膜电位去极化，而 IAA 和溶剂对照二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）则不会产生这种效果。4. IAA 可以保护细胞免受吲哚 - 3 - 丙酮酸对膜电位的破坏作用：既然 IAA 对膜电位没有明显影响，而 I3P 会破坏膜电位，那么 IAA 能否保护细胞免受 I3P 的毒性影响呢？研究人员对此进行了测试。在急性暴露实验中，同时添加 I3P 和 IAA 时，细胞的膜电位与只添加 I3P 时相似且较低，说明短时间内 IAA 不能保护细胞免受 I3P 对膜电位的破坏。但在 24 小时的长时间孵育实验中，情况有所不同。当 I3P 浓度较低（10 - 25 μM）时，添加 IAA 会使细胞的膜电位升高；当 I3P 浓度处于中等水平（50 - 75 μM）时，添加 IAA 与否对膜电位没有影响；当 I3P 浓度较高（>100 μM）时，IAA 能部分减轻 I3P 对膜电位的影响。

对于ipdC突变体，在指数期，较低浓度（10 - 50 μM）的 IAA 能使突变体的膜电位恢复到野生型水平，而较高浓度（75 - 100 μM）则不能。这表明 IAA 可以通过两种方式保护细胞：在膜电位较低的细胞中，IAA 帮助恢复膜电位；在长时间与 IAA 孵育时，IAA 能介导细胞对较低浓度 I3P 的适应。5. 其他吲哚衍生物对巴西固氮螺菌静息膜电位有短暂影响：巴西固氮螺菌能合成多种吲哚衍生物，如色胺（tryptamine，TAM）、吲哚 - 3 - 乙酰胺（indole - 3 - acetamide，I3A）和吲哚 - 3 - 乳酸（indole - 3 - lactic acid，I3LA）。研究发现，当野生型菌株暴露于 100 μM 的 TAM 或 I3LA 1 小时时，静息膜电位会显著下降，但暴露于 I3A 时则没有这种现象。然而，长时间（24 小时）暴露于这三种吲哚衍生物，都不会影响细菌的膜电位。TAM 对野生型菌株的生长速率没有影响，而 I3A 和 I3LA 会使生长速率略有增加，但它们都不能作为巴西固氮螺菌的唯一氮源或碳源。

研究人员还用 Salkowski 试剂检测了野生型和ipdC突变体菌株中吲哚类物质的含量，发现只有在添加色氨酸的情况下，才能在细胞内和细胞外检测到显著的吲哚类物质，且野生型和突变体之间没有显著差异。这说明两种菌株产生的吲哚类物质可能在种类上存在差异，并且由色氨酸分解代谢产生的吲哚类物质（如 I3LA 和 I3P）会降低膜电位。6. IpdC 细胞可能存在翻译减少的情况：已有研究表明吲哚会导致细菌细胞内蛋白质错误折叠。研究人员通过检测绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表达来探究ipdC突变体的翻译情况。在野生型细胞中，用 I3P 或 IAA 处理 24 小时后，GFP 的表达量没有变化。但在ipdC突变体中，无论在指数期还是稳定期，GFP 的荧光强度都比野生型低。通过蛋白质免疫印迹分析发现，这是由于突变体中 GFP 的含量减少，而gfp转录本的丰度在突变体和野生型之间没有差异，这表明突变体中 GFP 含量的减少可能是翻译减少或蛋白质降解增加导致的。

为了进一步验证ipdC突变体的翻译活性，研究人员用亚致死浓度的氨基糖苷类抗生素（如卡那霉素和壮观霉素）处理突变体细胞，这些抗生素会干扰核糖体活性。结果发现，ipdC突变体对这些抗生素的抗性比野生型更强，这进一步说明ipdC突变体的翻译活性较低。7. IpdC 敲除和 I3P 干扰巴西固氮螺菌对小麦根的附着：考虑到吲哚衍生物对巴西固氮螺菌生理的影响，研究人员比较了野生型和ipdC突变体菌株对小麦（Triticum aestivum）根的定植能力。结果发现，ipdC突变体在小麦根上的定植能力明显低于野生型，其生物膜形成能力也受到影响，这可能是导致定植减少的原因。

研究人员还测试了 I3P 和 IAA 单独或组合添加对野生型菌株定植小麦根表面能力的影响。结果表明，添加 I3P 会降低野生型的定植能力，而添加 IAA 则会增加定植能力。当同时添加 I3P 和 IAA 时，野生型对小麦根的定植水平恢复到未添加吲哚衍生物的对照水平。这说明 IAA 可以减轻 I3P 对细胞生理的毒性影响。然而，在生物膜形成方面，I3P 和 IAA 单独或组合添加都会影响野生型的生物膜形成，这表明 IAA 的缓解作用可能只针对细菌生理和植物 - 根关联，而在非生物表面定植方面不明显。

讨论

越来越多的证据表明 IAA 在细菌中是一种重要的信号分子，它参与调节细菌的多种生理过程，如细胞分裂、生长、运动性、酶产生、生物膜形成以及与植物宿主的相互作用等。在本研究中，发现 IAA 生物合成在巴西固氮螺菌中具有重要的生理作用，它可以保护细菌免受吲哚类物质对膜电位稳态的毒性影响。

ipdC突变体的生长速率降低、生理状态改变以及膜电位去极化，都表明 IAA 生物合成途径对维持细菌正常生理功能至关重要。外源添加 IAA 合成前体导致野生型菌株膜电位降低，这与突变体的表型一致，说明突变体可能因积累吲哚衍生物而影响膜电位。

IAA 在细菌生长的稳定期积累，且其生物合成受多种因素调控，包括稳定期和应激抗性 σ 因子 RpoS。IAA 对细菌的保护作用可能与其恢复去极化膜电位的能力有关，这一发现为解释 IAA 在其他细菌应对非生物胁迫中的作用提供了新的视角。

同时，研究还发现降低膜电位的条件（如ipdC突变或添加吲哚类物质）会导致蛋白质翻译减少，这与之前的研究结果一致，即吲哚类物质会影响蛋白质合成、折叠和稳定性。IAA 可能通过调节翻译过程来维持细菌细胞的正常生理功能。

此外，IAA 对膜电位的保护作用在不同条件下有所不同。短时间暴露于 IAA 可恢复ipdC突变体的膜电位，但对野生型菌株在 I3P 处理下的膜电位没有影响。长时间孵育时，IAA 能减轻 I3P 对野生型菌株膜电位的毒性影响，并且在小麦根表面定植实验中也观察到类似的缓解作用，这表明 IAA 的保护作用与细菌在植物根际的生理过程密切相关。

总之，IAA 及其通过 IpdC 的生物合成途径在巴西固氮螺菌中主要起着维持膜电位稳态和调节翻译的作用。在营养限制或应激条件下，细菌生长和代谢减缓，吲哚类物质积累，此时 IAA 的产生或对 IAA 的感知和响应能力可以帮助细菌减轻吲哚类物质的毒性，从而获得生存优势。由于 IAA 在土壤和根际细菌中广泛产生，且 IpdC 途径在许多细菌中占主导地位，因此本研究中发现的 IAA 在巴西固氮螺菌生理学中的作用可能在多种土壤细菌中都存在，这对于理解根际微生物群落的生态功能具有重要意义。

材料和方法

1. 细菌菌株、培养基和生长条件：本研究使用了多种细菌菌株和质粒，包括巴西固氮螺菌的野生型菌株 Sp7、ipdC突变体菌株等。巴西固氮螺菌在不同的培养基中生长，如以苹果酸为碳源、氯化铵为氮源的基本培养基（MMAB），或胰蛋白胨 - 酵母提取物（TY）培养基。培养时添加不同的抗生素，如卡那霉素、四环素等，以筛选含有相应质粒的菌株。吲哚衍生物（I3P、IAA 等）以不同浓度添加到细菌培养物中，分别进行 1 小时的急性暴露或 24 小时的持续暴露实验。细菌生长实验在 96 孔板中进行，通过测量 OD₆₀₀值来监测细菌生长速率，每个实验设置多个生物学重复和技术重复。
2. IpdC 插入突变和质粒构建用于 ipdC 互补启动子活性研究：构建ipdC插入突变体时，将ipdC基因内的一段 200 bp 序列克隆到 pKNOCK - Gm^r载体中，再通过三亲交配将重组质粒导入巴西固氮螺菌 Sp7 中。为了实现ipdC的互补，将ipdC基因的上游启动子区域和开放阅读框克隆到 pBBR 载体中。同时，构建了ipdC启动子报告质粒，将ipdC基因上游的一段序列克隆到 pFUS1 载体中，用于检测启动子活性。
3. 使用 Salkowski 方法比色检测细胞外和细胞内吲哚衍生物：采用 Salkowski 方法检测吲哚衍生物，但进行了一些修改。将细菌在含有或不含有色氨酸的 MMAB 培养基中培养 96 小时后，离心收集上清液和细胞沉淀。上清液与 Salkowski 试剂混合，沉淀经洗涤、超声裂解后取上清，同样与 Salkowski 试剂反应。反应后，在黑暗中室温孵育，使干扰测量的沉淀盐沉降，然后取上清液在微孔板中测量吸光度，通过与已知浓度的 IAA 标准曲线对比，估算吲哚衍生物的含量。每个实验设置两个生物学重复，每个生物学重复包含三个技术重复。
4. 显微镜观察：用 FM4 - 64 染料对细菌细胞膜进行染色，将染料加入到处于对数中期（OD₆₀₀ = 0.6）或稳定期（OD₆₀₀ = 2.5）的细菌培养物中，室温黑暗孵育 5 分钟。然后用尼康 Eclipse 80i 荧光显微镜，通过 ×100 油浸物镜观察细胞，使用氩离子激光激发，在 515/630 nm 处检测发射光。利用 ImageJ Fiji 软件测量细胞的长度、宽度，并根据公式计算细胞体积。该实验重复三次，综合数据用于绘制图表。
5. β - 葡萄糖醛酸酶活性测定用于启动子活性分析：通过将ipdC启动子区域克隆到含有无启动子gusA基因的 pFUS1 载体上，利用 β - 葡萄糖醛酸酶活性测定来评估ipdC启动子活性。将携带相应载体的巴西固氮螺菌菌株在含有四环素的 TY 培养基中过夜培养，洗涤后接种到不同氮源条件的 MMAB 培养基中培养。培养后，取小体积培养物进行处理，加入对硝基苯 - β - D - 葡萄糖醛酸苷作为底物，用酶标仪在 405 nm 波长下每隔 2 分钟测量一次吸光度，持续 1 小时。每个培养物设置三个重复，进行三个独立实验。
6. 使用 DiSC₃(5) 测量膜电位：按照之前的方法使用 DiSC3 (5) 测量膜电位。将巴西固氮螺菌菌株在含有抗生素的 MMAB 培养基中过夜培养，洗涤后重新接种到新鲜培养基中培养至指数期或稳定期。调整细胞浓度至 OD₆₀₀ = 1.0，加入 DiSC3 (5) 染料后立即在 622/670 nm 处测量荧光强度。然后加入 CCCP（终浓度 10 μM），再次测量荧光强度。实验设置多个生物学重复和技术重复，记录添加 CCCP 或 DMSO 前后的荧光变化。
7. 蛋白质免疫印迹分析：提取巴西固氮螺菌野生型和ipdC突变体携带 pHRGFP 质粒的全细胞蛋白质提取物，通过超声破碎细胞。蛋白质经 10% SDS - PAGE 凝胶分离后，转移到聚偏二氟乙烯膜上，用含有 0.1% Tween 20 和 5% 脱脂奶粉的 Tris 缓冲盐水封闭。用抗 GFP 抗体（1:2000 稀释