发现新 “操控者” VPA1365：破解副溶血性弧菌致病 “密码”

《Applied and Environmental Microbiology》：Role of the TPR family protein VPA1365 in regulating type III secretion system 2 and virulence in Vibrio parahaemolyticus

本文聚焦副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus），发现 T3SS2 基因簇中的 TPR 家族蛋白 VPA1365，它可调控 T3SS2 及毒力相关基因表达，影响细菌多种致病能力。研究为解析该菌致病机制、防控相关疾病提供新视角，极具科研与应用价值。

　　

副溶血性弧菌的危害与研究现状

副溶血性弧菌广泛分布于海洋、河口和淡水区域，不仅会引发水生经济动物的严重弧菌病，还能导致人类患上急性腹泻、败血症等危及生命的疾病。其致病性与多种毒力因子相关，其中 III 型分泌系统 2（T3SS2）尤为关键。T3SS2 编码在染色体 2 上，存在于所有临床分离株中，而环境分离株多不含此系统，这表明 T3SS2 在副溶血性弧菌引发的食源性疾病中起着重要作用。

T3SS 广泛存在于革兰氏阴性病原体中，是一种能够将效应蛋白注入宿主细胞的针状结构，可劫持宿主信号通路，迅速引发疾病。在副溶血性弧菌中，T3SS1 与细胞毒性紧密相关，T3SS2 则主要负责细菌在体内的定植能力和肠毒性。T3SS2 编码在一个 80kb 的致病岛（Vp - PAI）中，在许多动物模型的组织侵袭和胃肠炎中发挥主要致病作用。

尽管 T3SS2 对副溶血性弧菌的致病性至关重要，但 T3SS2 基因簇中许多基因的生物学功能以及其转录调控网络仍不明确。此前研究虽已发现一些调控 T3SS2 的因子，如 AraC/XylR 型转录因子 ExsA、OmpR 家族转录因子 VtrB 等，但 T3SS2 的调控模式尚未完全阐明，T3SS2 基因簇中一些假设蛋白的生物学功能也有待深入探索。

研究材料与方法

1. 细菌菌株、质粒和生长条件：研究中使用了多种大肠杆菌（Escherichia coli）和副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）RIMD2210633 及其衍生突变株。这些菌株在 37°C 的 LB 培养基中生长，根据实验需求添加不同浓度的抗生素，如 100μg/mL 羧苄青霉素（Carb）、24μg/mL 氯霉素（Cm），并使用 1mM 异丙基 β - D - 1 - 硫代半乳糖苷（IPTG）诱导相关蛋白表达，用 0.04%（wt/vol）胆汁盐刺激 VopD2 表达。
2. 缺失突变体和互补菌株的构建：按照之前的方法构建vpa1365和vscN2（vpa1338）的框内缺失突变体。通过 PCR 和测序对突变体进行确认。同时，将vpa1365、vtrA、vtrB的开放阅读框（ORF）克隆到 pMMB207 质粒中，转化到 Δvpa1365菌株中，构建互补菌株，同样通过 PCR 和测序进行验证。
3. 序列分析：利用 InterPro 工具识别 VPA1365 的保守结构域，通过 SWISS - MODEL 预测其三维蛋白结构，使用 MEGA - X 程序的邻接法构建系统发育树，分析 VPA1365 与其他物种的同源性。
4. 细胞毒性和黏附试验：通过测量感染 HeLa 细胞后释放的乳酸脱氢酶（LDH）来评估细菌的细胞毒性。将过夜培养的副溶血性弧菌菌株调整浓度后感染 HeLa 细胞，2 小时后检测 LDH 释放量。同时，裂解感染的 HeLa 细胞，通过平板计数计算细菌的黏附率。
5. 溶血活性试验：将过夜培养的菌株离心、洗涤后，调整浓度并点样在 Wagatsuma 血琼脂基础上，37°C 培养 37 小时，测量溶血圈直径以评估溶血活性。
6. 生物膜形成试验：将过夜培养的菌株调整浓度后加入 96 孔聚苯乙烯微孔板中，37°C 静态培养 31 小时，染色并溶解结晶紫，通过酶标仪在 570nm 处测定生物膜含量，以每细胞密度的总生物膜量进行标准化。
7. 免疫印迹分析：将不同菌株在不同环境因素下培养后，收集上清蛋白和细胞沉淀，进行 SDS - PAGE 电泳和免疫印迹分析，检测 VopD2 蛋白的表达和分泌情况。
8. EMSA 试验：将vpa1365的 ORF 区域插入 pColD1 质粒，转化大肠杆菌 BL21（DE3），诱导表达并纯化 VPA1365 - His 蛋白。制备带有 5′ - FAM 荧光标记的 DNA 探针，与 VPA1365 - His 蛋白孵育后进行电泳迁移率变动分析（EMSA），观察蛋白与 DNA 的结合情况。
9. 定量实时逆转录 PCR 分析：提取不同菌株在含有 0.04% 胆汁盐的 LB 培养基中生长至稳定期的总 RNA，逆转录为 cDNA 后，使用实时荧光定量 PCR 检测 T3SS2 相关基因、毒力相关基因的表达水平，以gyrB基因作为内参，通过 2^?ΔΔCt方法计算相对 mRNA 表达值。
10. 动物感染：使用幼兔感染模型评估细菌的 T3SS2 功能和肠道定植能力，给幼兔口服感染 WT 和 Δvpa1365菌株，计数小肠组织中的细菌数量并进行病理切片分析。利用斑马鱼感染模型评价 VPA1365 对细菌毒力的影响，给斑马鱼肌肉注射感染 WT、Δvpa1365和 ΔvscN2菌株，观察并记录斑马鱼的存活情况。
11. 统计分析：使用 GraphPad Prism 7.01 软件进行统计分析，结果以平均值 ± 标准差（n = 3）表示，通过单因素方差分析和 Dunnett’s 事后检验或t检验计算P值，P≤0.05 为显著差异，P≤0.01 为极显著差异，P>0.05 为无显著差异。

研究结果

1. vpa1365 的鉴定和序列分析：vpa1365的 ORF 包含 489 个碱基对，编码 163 个氨基酸，位于副溶血性弧菌 RIMD2210633 小染色体的 T3SS2 基因簇中。VPA1365 蛋白含有三个保守的四肽重复（TPR）结构域，这一结构域可介导蛋白质 - 蛋白质和蛋白质 - DNA 相互作用，暗示其可能具有调节功能。通过结构预测发现，VPA1365 与霍乱弧菌（Vibrio cholerae）中的一种调节因子 A0A7Z7VL62_VIBCL 结构相似度达 90.68%。系统发育树分析表明，vpa1365在不同弧菌物种中具有较高的序列相似性，氨基酸同一性为 60% - 85%。
2. vpa1365 缺失降低副溶血性弧菌的肠道定植能力：构建 Δvpa1365突变株及相关互补菌株，生长曲线结果显示，在 LB 液体培养基中 37°C 培养时，WT、Δvpa1365和互补菌株的生长无显著差异。但感染幼兔 38 小时后，Δvpa1365感染组幼兔小肠中的细菌载量显著低于 WT 感染组。病理分析表明，Δvpa1365感染组肠道组织损伤较轻，而 WT 感染组肠道组织出现广泛明显的肠绒毛脱落、固有层和肌肉层结构不明显等严重损伤，这表明vpa1365在副溶血性弧菌的肠毒性和肠道定植中起重要作用。
3. VPA1365 通过直接结合 vtrA 的启动子调节 T3SS2 的表达和分泌：在胆汁盐存在的情况下，检测 WT、Δvpa1365、Δvpa1365 - vpa1365和 Δvpa1365 - pMMB207中多个 T3SS2 相关基因的表达水平，发现 Δvpa1365和 Δvpa1365 - pMMB207中这些基因的转录水平显著低于 WT，而 Δvpa1365 - vpa1365中基因表达水平有所恢复。VopD2 作为 T3SS2 功能的指标，其分泌情况也呈现类似趋势，WT 中 VopD2 的分泌显著高于 Δvpa1365和 Δvpa1365 - pMMB207，互补菌株可恢复至 WT 水平，表明 VPA1365 正调控副溶血性弧菌中 T3SS2 蛋白的表达和分泌。

通过 EMSA 试验发现，VPA1365 蛋白可浓度依赖性地结合vtrA的启动子，添加未标记的冷 DNA 可使结合条带减弱，而与vtrB、vpa1380和vpa1364的启动子无结合现象，说明 VPA1365 直接结合vtrA启动子激活 T3SS2 相关基因表达，进而影响副溶血性弧菌的毒力。

研究还发现，环境因素可诱导 T3SS2 的表达和分泌，在 0.1M NaCl 条件下，WT 中可观察到 VopD2 的表达和分泌，而 Δvpa1365缺失该能力，互补菌株可恢复。此外，在 Δvpa1365中过表达 VtrA 或 VtrB 可显著增加 T3SS2 相关基因的表达水平和 VopD2 的分泌，但分泌水平仍低于 WT 和互补菌株，揭示了 VPA1365 在感知环境信号（低 NaCl）以及与 VtrA/VtrB 之间广泛的调控联系。4. vpa1365 缺失降低对 HeLa 细胞的细胞毒性和黏附率：检测 WT、Δvpa1365和互补菌株对 HeLa 细胞的细胞毒性和黏附率，结果显示，Δvpa1365的细胞毒性和黏附率显著低于 WT，互补该基因可部分恢复其功能，表明vpa1365在促进对 HeLa 细胞的黏附能力和细胞毒性方面起关键作用。5. VPA1365 通过直接结合 scrG、pilA 和 mshA 的启动子促进溶血活性和生物膜形成：研究发现，Δvpa1365的生物膜形成能力和溶血活性显著低于 WT 和 Δvpa1365 - vpa1365。进一步检测相关毒力基因的表达，发现 VPA1365 正调控这些基因的表达。EMSA 试验表明，VPA1365 可直接结合pilA、mshA和scrG的启动子，以浓度依赖性方式调节生物膜形成和溶血活性，但与tdhA和tdhS的启动子无结合，提示其对溶血活性的调节可能是间接的。6. VPA1365 结合基序的鉴定：选择scrG启动子进行 EMSA 分析，对其六个截断片段进行检测，发现 VPA1365 可结合片段 1 - 5，而不结合片段 6。进一步删除 140 - 166 位核苷酸的片段（ΔPscrG），VPA1365 也不与之结合。利用 MEME - Suite 工具预测出 VPA1365 在vtrA、pilA、mshA和scrG启动子中的结合基序为 5′ - AAAATAAAGCGCATAG - 3′，该基序与scrG启动子 140 - 166 位核苷酸区域高度相似，进一步证实 VPA1365 直接结合启动子并调节基因表达。7. 缺乏 vpa1365 减弱副溶血性弧菌对斑马鱼的毒力：用 WT、Δvpa1365和 ΔvscN2菌株感染斑马鱼，结果显示，WT 感染组斑马鱼在 6 天内全部死亡，而 Δvpa1365和 ΔvscN2感染组斑马鱼的相对存活率分别约为 73% 和 63%，表明 VPA1365 对副溶血性弧菌的毒力至关重要。

讨论

1. T3SS2 的重要性及 VPA1365 的发现意义：副溶血性弧菌的 T3SS2 在其致病过程中起着不可或缺的作用，而其表达受到众多调节因子的严格控制。本研究鉴定出的 TPR 家族蛋白 VPA1365 正调控 T3SS2 的功能，这一发现拓宽了毒力基因的调控网络，加深了对副溶血性弧菌致病分子机制的理解。
2. VPA1365 的作用机制探讨：VPA1365 含有三个 TPR 结构域，可直接结合 T3SS2 主调节因子vtrA的启动子，进而调节vtrB和 T3SS2 相关基因的表达。此外，VPA1365 可能通过 VtrA/VtrB 调节 T3SS2，且在低 NaCl 条件下，VPA1365 对 T3SS2 的正调控作用更为显著。同时，VPA1365 在不同弧菌物种中高度保守，暗示其调控机制可能在其他弧菌中广泛存在。
3. VPA1365 对多种毒力因子的影响：VPA1365 不仅影响 T3SS2 的功能，还对副溶血性弧菌的细胞毒性、黏附能力、生物膜形成和溶血活性等毒力因子产生影响。它可直接结合mshA、pilA和scrG的启动子，间接调节溶血活性，可能作为全局调节因子影响多种毒力基因的表达水平。此外，预测的 VPA1365 结合基序与含有 TPR 结构域的蛋白结合的 DNA 序列相似，均富含 AT 区域，但 VPA1365 可能通过与其他核仁结合蛋白相互作用来调节转录，具体机制有待进一步研究。
4. 斑马鱼模型的验证：利用斑马鱼感染模型证实，VPA1365 对副溶血性弧菌的毒力具有重要影响。Δvpa1365感染组斑马鱼的存活率显著高于 WT 感染组，且高于 ΔvscN2感染组，表明 VPA1365 对毒力的影响不仅限于 T3SS2，其缺失可显著降低副溶血性弧菌在幼兔和斑马鱼中的致死率和定植能力。

结论

本研究发现位于 T3SS2 基因簇中的 TPR 家族蛋白 VPA1365，它通过直接结合启动子区域调节 T3SS2 的表达，对副溶血性弧菌的肠道定植产生重要影响。同时，VPA1365 作为全局调节因子，调控副溶血性弧菌的溶血活性、生物膜形成、黏附能力和细胞毒性。其对生物膜形成和黏附的调节可能通过直接结合pilA、mshA和scrG的启动子实现。本研究构建了 VPA1365 的调控网络，明确了其在副溶血性弧菌多种毒力因子中的作用，为深入了解副溶血性弧菌的致病机制提供了重要依据。