微调甲基接受趋化传感器蛋白 MCP_0387 丰度，助力细菌精准趋化适应！

《Applied and Environmental Microbiology》：Role of a single MCP in evolutionary adaptation of Shewanella putrefaciens for swimming in planktonic and structured environments

本文聚焦希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）CN-32，通过实验进化筛选出在多孔环境中扩散能力增强的突变体。研究发现，单个甲基接受趋化传感器蛋白（MCP_0387）的适度增加，能以低代谢成本提升趋化能力，为理解细菌适应机制提供新视角。

　　

引言

许多细菌借助鞭毛运动，鞭毛是从细胞表面伸出的长螺旋蛋白质细丝，由嵌入细胞包膜的马达旋转驱动，帮助细菌在液体环境中游泳和在合适表面上群集。细菌的鞭毛运动受一个或多个趋化系统控制，环境信号由不同的甲基接受趋化传感器蛋白（MCPs）感知，这些蛋白在细胞质膜内组装成大型阵列。MCPs 感知的信号影响趋化组氨酸激酶 CheA 的活性，CheA 使响应调节因子 CheY 磷酸化，CheY~P 直接与鞭毛马达相互作用，诱导旋转方向切换或在某些情况下暂停旋转，从而改变细菌的运动方向。

形成和运作鞭毛代谢成本高昂，在统一培养条件下，鞭毛细胞存在显著生长劣势，因此，细菌进化出了调节鞭毛基因表达的机制，以优化代谢负担与趋化和运动益处之间的适应性权衡。实验进化研究表明，细菌增强趋化性时，生长与运动的平衡可通过突变改变，通常是由于鞭毛基因表达升高，导致游泳速度加快和趋化漂移增加。

希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）CN-32 是一种兼性厌氧的 γ - 变形杆菌，其鞭毛和趋化机制比大肠杆菌复杂。它拥有两个不同的鞭毛系统，即极性和侧生系统，分别由两个独立的基因簇编码。极性鞭毛是主要系统，介导主要推进、螺纹运动和趋化反应；侧生鞭毛在复杂营养物质存在或主极性鞭毛负载高时诱导形成，能在结构化环境中提供额外推进力，降低细胞趋化转向角度，但调控机制尚不清楚。希瓦氏菌在结构化环境（如软琼脂）中的有效运动和扩散取决于多种因素，包括培养基营养成分、细胞趋化能力、极丝几何形状、侧生鞭毛存在以及依赖 c - di - GMP 的粘附因子产生等。本研究旨在探究希瓦氏菌通过实验进化实现更好扩散的机制，是否会产生影响极性和 / 或侧生鞭毛系统的调节突变体。

结果

1. 希瓦氏菌软琼脂扩散进化：为深入了解影响希瓦氏菌在结构化多孔环境中扩散的因素及其调控机制，研究采用实验进化方法，以筛选能在软琼脂中更好扩散的自发突变体。实验使用了一种可将马来酰亚胺连接的荧光染料与极性和侧生鞭毛丝偶联的希瓦氏菌 CN - 32 菌株，便于通过荧光显微镜监测鞭毛状态。实验流程为将指数生长期的细胞点种在 LB 软琼脂平板上，扩散 24 小时后，从可见扩散区域边缘分离细胞，重新接种到新鲜软琼脂上，重复 14 次。最终获得的突变菌株 G14 扩散直径显著增加，且该增强的扩散表型在菌株保存和在固体或液体培养基中培养后仍稳定保留。时间推移扫描显示，G14 在接种时就具有扩散优势，且随着扩散区域生长持续优于野生型。
2. 增强扩散突变细胞的鞭毛和形态未受影响：先前研究表明，侧生鞭毛的产生和主极丝的长度会影响希瓦氏菌在软琼脂中的扩散。因此，研究测定了野生型和 G14 突变细胞的鞭毛状态。结果显示，突变体和野生型细胞的形态、主丝长度、鞭毛细胞数量以及每个细胞的平均鞭毛数均无显著差异。这表明获得的突变体中鞭毛数量未向侧生丝转移，影响鞭毛一般调控的突变不太可能发生。
3. 单个 MCP 是扩散增加的主要原因：对进化后的高运动性菌株 G14 的三个克隆进行测序，分析可能影响运动性的突变。除了鞭毛蛋白中的半胱氨酸取代外，所有测序突变体中唯一直接与鞭毛介导的运动相关的突变是在孤儿基因 Sputcn32_0387 上游缺失 24bp。该基因编码的蛋白质是希瓦氏菌 CN - 32 的 36 个 MCPs 之一，称为 MCP_0387。其 N 端区域（至氨基酸位置 287）预测位于周质，具有 Cache_3 - Cache_2 结构域，可能用于信号感知，但信号身份未知。为确定 MCP_0387 是否参与软琼脂中的增强扩散，在进化菌株 G14 中引入该基因的框内缺失，结果软琼脂扩散表型完全丧失，表明 MCP_0387 直接参与扩散表型，且突变未消除其编码基因的转录。进一步构建一系列突变体进行软琼脂扩散实验，结果表明 MCP_0387 是软琼脂中扩散增加功能获得的主要原因。
4. 鉴定出的缺失突变增加了 MCP_0387 的产生：由于 24bp 基因缺失位于 Sputcn32_0387 上游，且基因缺失完全消除了扩散优势甚至降低了扩散能力，研究推测该缺失影响转录活性，导致 MCP 丰度增加。通过创建转录融合到基于lux的报告基因，直接在体内通过细胞发出的荧光定量 Sputcn32_0387 的表达，结果显示 Δ24 突变体的荧光显著但适度高于野生型（约 116%）。创建 Sputcn32_0387 - mCherry 融合基因，通过荧光显微镜和 western blotting 检测发现，Δ24 突变体中 MCP_0387 - mCherry 的丰度比野生型增加约 1.5 倍。当从质粒异位产生更高水平的 MCP_0387 时，发现其对相应菌株的扩散能力产生负面影响。由此得出，缺失导致 MCP 产生和丰度适度增加，进而增强软琼脂中的扩散。
5. MCP_0387 影响希瓦氏菌的趋化性：MCP_0387 是软琼脂中增强扩散的主要贡献者，表明观察到的表型可能由趋化信号感知差异介导。通过对野生型、Δ24 和 Δ24Δ387 细胞在自由游泳条件下进行三维（3D）追踪，发现三种菌株的瞬时游泳速度分布、最大速度以及运行持续时间和翻滚频率分布均相似，排除了游泳速度是扩散增加的主要因素。在不同培养基中进行软琼脂扩散实验，发现突变体在 50% LB 中仍保留扩散优势，但在 10% LB、LM 培养基或含 0.5% 酪蛋白氨基酸的缓冲液中优势不显著。利用微制造 chambers 在不同培养基梯度中探测突变体的漂移，结果表明受体 0387 负责对 LB 梯度的特定趋化反应，有助于 Δ24 菌株在 LB 软琼脂上的增强扩散。
6. MCP_387 水平影响软琼脂中的运动性：通过全息分析软琼脂基质中 MCP_0387 突变体细胞与野生型细胞的运动模式，发现细胞在软琼脂中呈现 “跳跃和捕获” 运动，即频繁改变方向且总体进展较少的时期被较长的运行打断。分析细胞运动的步长、限制比、方向相关性和方向偏差等参数，发现 Δ24 菌株的步长比野生型和 Δ24Δ0387 更长，且标准差更大，步长是 Δ24 扩散增加的主要贡献因素。
7. MCP_387 增强的扩散对生长无显著影响：先前研究表明，基于鞭毛基因表达增加和形成更长或额外鞭毛的软琼脂扩散或群集实验进化会导致生长显著下降。本研究测定 MCP_0387 导致的扩散增加是否有同样影响，结果显示野生型和突变菌株在营养丰富（LB）和营养限制（4M）培养基中的生长无显著差异。

讨论

实验进化是研究细菌适应和进化的有用工具。本研究利用具有双鞭毛系统的希瓦氏菌在软琼脂中进行实验进化，探索其潜在调节系统在复杂环境中扩散的突变潜力。与大肠杆菌常见的一般鞭毛调节进化路径不同，本研究中获得的增强扩散突变体更好的扩散能力归因于单个趋化传感器蛋白 MCP_0387 的过量产生，这表明突变菌株在适当营养条件下趋化能力增强。

一般来说，鞭毛介导的运动要求细菌平衡趋化益处与分配细胞资源用于运动的成本，鞭毛合成受到多层次的复杂调控。在实验选择增强扩散和趋化性时，常观察到运动性与生长之间的权衡，突变通常映射到直接或间接参与鞭毛调节的因素。例如，大肠杆菌中常见的更好扩散表型突变是插入序列（IS）元件整合到flhDC操纵子的调节区域，导致鞭毛合成上调；铜绿假单胞菌的趋化突变体形成更多极性鞭毛，虽能更好地群集，但生长受到负面影响。而本研究中突变发生在趋化感觉系统，导致高度依赖环境的扩散升级，且无需大量合成蛋白质，限制了对生长的权衡。不过，由于仅分离了一条突变体系列，尚不清楚趋化系统突变是否是希瓦氏菌在这些条件下实验进化的主要结果，未来需更多不同环境条件下进化的希瓦氏菌菌株平行实验来探究。

MCP_0387 只是希瓦氏菌 36 种潜在 MCPs 之一，其在自发突变体中的过量产生水平较小（1.2 - 1.5 倍），而更高水平的异位产生反而对扩散产生负面影响。MCPs 形成三聚体二聚体，组装成大型有序阵列，不同 MCPs 在阵列中的丰度差异很大。在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和苜蓿中华根瘤菌中，不同 MCPs 的化学计量比都有很大差异。MCPs 的紧密组织聚类有助于协同作用和信号处理，改变 MCP 丰度平衡会改变对相应信号的趋化敏感性。MCP 丰度可根据环境条件和化学效应物的存在进行调整，但 MCP_0387 是否如此仍有待研究。与大肠杆菌中 MCP Tsr 水平因群体异质性而升高不同，希瓦氏菌中 MCP_0387 突变是通过永久增加平均水平，可能富集了高表达 MCP_0387 的细胞，在实验条件下发挥先锋作用，但过高的 MCP_0387 产量可能干扰复杂环境中的信号转导，导致扩散下降。目前尚不清楚 Sputcn32_0387 上游基因区域的缺失如何影响基因转录活性，需要进一步研究其对 sigma 因子识别、调节因子结合或非翻译区域结构的影响。

希瓦氏菌的趋化潜力才刚刚开始探索，MCP_0387 响应的信号仍未知。MCP_0387 在希瓦氏菌物种中广泛存在同源物，其周质结构域含有 Cache 结构域，属于 Cache_3 - Cache_2 亚家族，可能结合多种潜在配体，但目前测试的潜在配体均未给出线索，相关研究仍在进行中。

细菌在单细胞水平的趋化游泳模式在浮游环境中研究较多，但在结构化环境中与自由游泳时差异很大。在软琼脂中，细胞运动呈现 “跳跃和捕获” 模式，希瓦氏菌的运动模式与大肠杆菌不同，其通过运行 - 反转 - 轻弹模式导航，鞭毛缠绕和侧生鞭毛活动可能有助于离开陷阱。本研究发现希瓦氏菌高运动性突变体倾向于更长的运行和更短的捕获时间，但具体机制仍需进一步研究确定鞭毛行为和突变体在软琼脂中短捕获状态的原因。

材料和方法

1. 生长条件和培养基：列出了研究中使用的大肠杆菌和希瓦氏菌 CN - 32 菌株。除非另有说明，细胞分别在 30°C（希瓦氏菌）和 37°C（大肠杆菌）的 LB 培养基中培养，使用卡那霉素和 2,6 - 二氨基庚二酸作为选择标记。希瓦氏菌菌株的生长实验在 1mL LB 或 4M 培养基中，于 30°C 在 24 孔微量滴定板中进行，每个实验至少有三个生物学重复，每个重复有四个技术重复。
2. 菌株构建：所有希瓦氏菌的修饰均按照先前方法构建，通过双同源重组，使用目标区域上下游 500bp 的侧翼区域生成开放阅读框缺失或整合带有点突变或遗传标记的开放阅读框。重组通过自杀质粒 pNPTS - R6K 从大肠杆菌 WM3064 接合实现，载体使用标准 Gibson 组装协议构建，引物列于相应表格。
3. 软琼脂扩散测定：软琼脂由 0.25%（wt/vol）选择琼脂在 LB 培养基、乳酸培养基（LM100）或补充 0.5%（wt/vol）酪蛋白氨基酸的 PBS 中制备。将预生长至指数生长期的菌株接种到软琼脂平板上，于 30°C 孵育过夜，直接比较的菌株总是接种在同一平板上。时间推移实验使用 Epson Perfection V39 扫描仪，通过 scanlag 软件记录图像系列，使用 Fiji ImageJ 分析图像，包括背景扣除、转换为 8 位、应用中值滤波器、分割菌落轮廓和量化等步骤。
4. 扩散进化测定：使用菌株 S8493 在 0.25% 选择琼脂的 LB 培养基中进行重复软琼脂扩散实验，从运动前沿小心吸取细胞用于重新接种下一轮扩散实验，14 个循环后，从运动前沿收获的细胞用于接种新鲜 LB 培养基，制备 10% DMSO 的冷冻保存液，于 - 80°C 储存。
5. 鞭毛丝标记和显微镜观察：将鞭毛蛋白单体表面暴露的苏氨酸残基替换为半胱氨酸以可视化鞭毛丝，从软琼脂扩散实验中收获细胞，进行染色和洗涤后，在定制显微镜设置下进行观察。使用 BacStalk 软件基于相差图像测量细胞体，使用 Fiji ImageJ 基于荧光显微镜图像测量鞭毛丝。
6. 菌株测序：使用 E.Z.N.A. 细菌 DNA 试剂盒提取染色体 DNA，按照制造商说明生成 TruSeq PCR - 免费测序文库，并在 Illumina MiSeq 机器上测序。使用 Geneious Prime 2022.0.1 分析读取，检测与希瓦氏菌 CN - 32 参考序列的变异，并导出进行进一步过滤和分析。
7. 液体培养基中的趋化实验：使用 PDMS 微腔室进行趋化漂移测量，微腔室由 Sylgard 184 在 SU8 - 基硅片模板上模塑制成，填充不同溶液形成浓度梯度。通过动态微分显微镜（DDM）和相微分显微镜（?DM）分析细胞运动，测量游泳速度、游泳细胞分数和群体平均漂移，算法实现为公开可用的 ImageJ 插件。
8. 全息显微镜数据采集：数字全息显微镜按照先前描述配置，用于浮游样品和琼脂样品的成像。浮游样品在指数生长期稀释后装入特定腔室，通过瑞利 - 索末菲反向传播重建光学场，根据平均平方位移区分运动和非运动细胞，正则化轨迹并识别细胞重定向事件。琼脂样品的成像和后处理与浮游样品类似，但对轨迹进行了步长、限制比、方向相关性和运动各向异性等参数的量化。
9. 统计分析：使用 R 统计语言的 pairwise.t.test 函数进行统计检验，设置双侧、非合并标准差、未配对参数，根据 Benjamini - Hochberg 校正方法计算P值调整。

致谢

本研究得到了德国研究基金会 DFG（TH831/8 - 1）对 K.M.T. 的资助，R.C. 感谢 DFG 资助 CO1813/2 - 1 的支持。