新型羊毛硫抗生素 mycoidesin：对抗单核细胞增生李斯特菌的潜在生物防腐剂

《Applied and Environmental Microbiology》：Mycoidesin, a novel lantibiotic, exhibits potent bacteriostatic activity against Listeria monocytogenes and effectively controls its growth in beef

这篇研究从土壤中筛选出能产生新型羊毛硫抗生素（lantibiotic）mycoidesin 的菌株。它对单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）抑菌活性强，稳定性高、生物安全性良好，在牛肉保鲜实验中效果显著，为食品行业防控该菌污染带来新希望。

　　

研究背景

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是重要食源性病原体，可引发多种严重疾病，如免疫功能正常者患肠胃炎、免疫功能低下者患全身性李斯特菌病、孕妇流产及新生儿李斯特菌病等。尽管其感染率相对较低，但住院率和死亡率较高，例如 2022 年欧盟国家有 2738 例李斯特菌病病例，1330 人住院，286 人死亡；美国每年约有 1600 例病例，死亡率达 20%-30%；中国在 2011 - 2016 年也报告了 253 例，死亡率为 25.7%。因该菌污染导致的食品召回，每年造成约 28 亿美元的经济损失。

食用被单核细胞增生李斯特菌污染的食物是感染和爆发李斯特菌病的关键原因。食品防腐剂能抑制微生物生长、防止食品变质和延长保质期。化学防腐剂虽成本效益高，但滥用可能危害人体健康，如引发过敏反应和致癌。天然食品防腐剂，如细菌素（bacteriocins），是由某些细菌核糖体合成的抗菌肽，对食源性病原体有强大抗菌活性，不影响食品感官品质，对人体无毒，深受消费者青睐。羊毛硫抗生素（lantibiotics）是一类研究较透彻的细菌素，含有特殊氨基酸。已广泛应用的乳酸链球菌素（Nisin）虽对多种食源性病原体有效，但在中性和碱性条件下稳定性和溶解性差，限制了其应用。因此，开发性能更优的新型细菌素迫在眉睫。

蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）群包含二十多种密切相关的物种，其中已鉴定出 20 多种不同类型的细菌素，部分对食源性病原体有抗菌作用。不过，该菌群仍有许多新型细菌素未被鉴定和表征。本研究以单核细胞增生李斯特菌为指示菌株，从中国各地采集的土壤样本中筛选蜡状芽孢杆菌群菌株，旨在发现新型抗菌物质，并对其结构、活性、机制、稳定性、生物安全性及在牛肉保鲜中的应用进行研究。

材料与方法

1. 产细菌素菌株的筛选：以单核细胞增生李斯特菌 ATCC19111 为指示菌株，对从中国不同地区和生境土壤中分离的 132 株蜡状芽孢杆菌群菌株进行筛选。通过 16S rRNA 序列分析鉴定菌株，并保存在实验室检测抗菌活性。将菌株在胰酪大豆胨液体培养基（TSB）中活化 12 小时，取 1 mL 培养物转至 100 mL TSB 培养基，25°C、200 rpm 振荡培养 24 小时。收集 1 mL 培养物测 600 nm 吸光度，用琼脂扩散法检测发酵上清液的抗菌活性。将有抗菌活性的上清液与混合蛋白酶（1 mg/mL 的 α - 糜蛋白酶和胰蛋白酶）在 30°C 孵育 3 小时，再次检测剩余抗菌活性。
2. 基因组测序和细菌素基因簇分析：将Bacillus mycoides LX30 菌株送诺禾致源生物信息科技有限公司，利用 HiSeq PE150 和牛津纳米孔平台进行全基因组测序。使用 PGCGAP version 1.0.35 软件组装基因组，用 AntiSMASH 和 BAGEL4 预测和分析细菌素基因簇，BLASTp 软件分析 mycoidesin 基因簇中各推定蛋白的功能。
3. Bacillus mycoides LX30 抗菌物质的纯化：挑取Bacillus mycoides LX30 单菌落，接种于 100 mL TSB 培养基，30°C、200 rpm 培养 12 小时，再转至 10 L TSB 培养基培养 8 小时。发酵液 4°C、12000×g离心 10 分钟，取上清液 10 L 与 1 L Amberlite XAD - 7HP 树脂在 4°C 振荡混合 6 小时。依次用 5 L 去离子水和 2.5 L 30%（体积 / 体积）乙醇洗涤树脂，用 1 L 80%（体积 / 体积）乙醇（pH 2.0）洗脱吸附的抗菌剂。洗脱液 45°C 旋转蒸发浓缩至 10 mL，10000×g离心 5 分钟，收集上清液得到抗菌粗提物（CE）。将 CE 用高效液相色谱（HPLC，WUFENG LC - 100 系统）进一步分析，以乙腈和含 0.1% 三氟乙酸的去离子水为流动相，在 C18 柱上分离，监测 220 nm 处流出液，收集有抗菌活性的组分冻干保存。
4. Bacillus mycoides LX30 抗菌物质的 LC - MS 和 LC - MS/MS 分析：用 Agilent 6540 超高清精确质量四极杆飞行时间液相色谱 - 质谱系统对 mycoidesin 进行液相色谱 - 质谱（LC - MS）分析，质谱条件为正离子模式，干燥气流速 9 L/min，雾化器压力 35 psig，毛细管温度 350°C，源电压 3.5 kV。用 LC - MS/MS 分析抗单核细胞增生李斯特菌物质的结构，碰撞诱导解离获取片段（碰撞能量 25 V）。
5. mycoidesin 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）的测定：采用微量稀释法测定 mycoidesin 对指示菌株的 MIC。称取 HPLC 纯化的 mycoidesin，溶于液体培养基配制成系列浓度（200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20 和 0.10 μM）。在 96 孔板中，将 50 μL 不同浓度的 mycoidesin 溶液与 50 μL 指示菌株菌液（1×10⁶ CFU/mL）混合，使 mycoidesin 终浓度为 100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10 和 0.05 μM。30°C 孵育 16 小时，观察无细菌生长的最低浓度为 MIC。将无可见细菌生长的培养物接种到琼脂平板上，24 小时后观察，杀死 99.9% 细菌群体的最低浓度为 MBC。以纯化的 Nisin A 为对照，比较二者对单核细胞增生李斯特菌菌株的 MIC 值。
6. mycoidesin 作用模式研究
   • UDP - MurNAc - 五肽的细胞内积累：将Bacillus cereus CMCC63301 和单核细胞增生李斯特菌 ATCC19111 培养至 OD₆₀₀为 0.3，加入氯霉素（130 μg/mL）孵育 15 分钟，再加入 mycoidesin（1× 和 2×MIC）和万古霉素（10×MIC，阳性对照）孵育 60 分钟。收集细胞，沸水浴处理 15 分钟，离心，冻干上清液。用 HPLC（Hypersil ODS 柱）分析肽聚糖前体 UDP - MurNAc - 五肽的细胞内积累，并通过质谱鉴定。
   • 时间 - 杀菌曲线：将Bacillus cereus CMCC63301 和单核细胞增生李斯特菌 ATCC19111 在 TSB 培养基中培养至 OD₆₀₀为 0.3，分别加入 1×MIC（Lm，0.39 μM；Bc，1.56 μM）、2×MIC（Lm，0.78 μM；Bc，3.13 μM）、4×MIC（Lm，1.56 μM；Bc，6.25 μM）、8×MIC（Lm，3.13 μM；Bc，12.50 μM）、16×MIC（仅用于Lm，6.25 μM）和 32×MIC（仅用于Lm，12.5 μM）的 mycoidesin，30°C 孵育 3 小时。每小时通过在 TSB 平板上计数 CFU 和测量培养物的 OD₆₀₀值监测细胞生长。
   • 钾离子释放检测：取 10 mL 单核细胞增生李斯特菌 ATCC19111 细胞悬液（OD₆₀₀ = 0.3），分别用 1×MIC（0.39 μM）、8×MIC（3.13 μM）和 32×MIC（12.5 μM）的 mycoidesin 处理；取Bacillus cereus CMCC63301 细胞悬液，用 1×MIC（1.56 μM）、2×MIC（3.13 μM）和 4×MIC（6.25 μM）的 mycoidesin 处理 1 小时，用 HI96750 钾离子光度计测量钾离子释放量。
   • 扫描电子显微镜（SEM）观察：将Bacillus cereus CMCC63301 和单核细胞增生李斯特菌 ATCC19111 在 TSB 培养基中培养至 OD₆₀₀为 0.3。Bacillus cereus细胞用 2×MIC（3.13 μM）和 4×MIC（6.25 μM）的 mycoidesin 在 30°C 处理 3 小时，单核细胞增生李斯特菌细胞用 8×MIC（3.13 μM）和 32×MIC（12.5 μM）的 mycoidesin 在 30°C 处理 3 小时。离心收集细胞（6000×g，10 分钟），用 PBS 缓冲液洗涤 3 次，2.5%（体积 / 体积）戊二醛 4°C 固定 12 小时。然后梯度脱水 10 分钟，用乙酸异戊酯处理 10 分钟，冻干机干燥 12 小时，喷金钯后用 Zeiss Gemini360 仪器观察。
7. mycoidesin 的细胞毒性和溶血活性检测：用 Cell Counting Kit - 8（CCK - 8）法在小鼠胚胎成纤维细胞（NIH/3T3）中评估 mycoidesin 的细胞毒性。将 NIH/3T3 细胞在 96 孔板中 37°C、5% CO₂培养 24 小时，加入不同终浓度（1、5 和 25 μM）的 mycoidesin PBS 溶液，37°C 孵育 24 小时。加入 CCK - 8 溶液孵育 3 小时，测量 OD₄₅₀值计算活细胞百分比，以 PBS 和紫杉醇（Sigma - Aldrich，美国）分别作为阴性和阳性对照。取除纤维蛋白的羊血，4°C、5000×g离心 5 分钟，洗涤沉淀细胞并重悬于 PBS 缓冲液。在 96 孔板中，将 50 μL 不同终浓度（1、5 和 25 μM）的 mycoidesin PBS 溶液与 50 μL 红细胞悬液混合，37°C 孵育 1 小时。4°C、1000×g离心 5 分钟，测量上清液在 405 nm 处的吸光度，以 PBS 和 1% Triton X - 100 分别作为阴性和阳性对照。
8. mycoidesin 的稳定性检测：将 mycoidesin（6.25 μM，4×MIC）和 Nisin A（12.5 μM，4×MIC）溶液调至 pH 7.0 和 8.0，分别在 37°C 和 60°C 孵育 12 小时。在 2、4、6、8、10 和 12 小时后，用琼脂扩散法，以Bacillus subtilis CMCC63501 为指示菌株，测量样品的剩余抗菌活性。
9. mycoidesin 在牛肉保鲜中的抗菌应用：从超市购买牛里脊，切成 3×3 cm、10±0.5 g 的肉块。在无菌超净平台上，肉块各面用紫外线照射 30 分钟，表面接种 100 μL 10⁵ CFU/mL 的单核细胞增生李斯特菌 ATCC19111，风干 30 分钟。然后将牛肉样品分别浸入 0.39 μM（1×MIC）、1.56 μM（4×MIC）和 3.13 μM（8×MIC）的 mycoidesin 溶液中 10 分钟，再风干 30 分钟。用无菌聚乙烯袋包装牛肉样品，4°C 储存，在第 0、3、6、9、12 和 15 天进行各项测量，以无菌生理盐水为对照。检测单核细胞增生李斯特菌的总菌落数时，取 10 g 牛肉样品与 90 mL 无菌生理盐水混合匀浆，将匀浆液涂布在 TSB 琼脂平板上，30°C 培养 24 小时后计数菌落。取匀浆液离心（10000×g，10 分钟），用 pH 计测量 pH 值。用蒸汽蒸馏法测定挥发性盐基氮（TVB - N），样品悬液过滤后，用凯氏定氮仪（K - 375；Buchi）进行蒸汽蒸馏，根据盐酸（0.01 M）消耗量计算 TVB - N 值。组建由 10 人组成的感官评价小组，基于牛肉的颜色、气味和质地进行评价，评价前对小组成员进行感官培训，成员各自独立评分，满分 10 分表示感官品质最佳，5 - 10 分为可接受，0 分为最差不可接受。
10. 统计分析：所有实验重复 3 次，结果以平均值 ± 标准差表示。使用 SPSS 22.0 软件进行 Student’s t检验，P≤0.05 为差异有统计学意义。

研究结果

1. 产细菌素菌株Bacillus mycoides LX30 的筛选：对 132 株蜡状芽孢杆菌群菌株进行抗单核细胞增生李斯特菌活性筛选，13 株有抗菌活性，其中Bacillus mycoides LX30 抗菌活性最强。该菌株产生的抗菌物质在对数生长期（4 - 12 小时）产生，10 小时时抑菌量最大，12 小时后抗菌活性消失，且能被蛋白酶降解，表明是细菌素，后续对该菌株及其细菌素展开深入分析。
2. Bacillus mycoides LX30 基因组测序和细菌素基因簇分析：Bacillus mycoides LX30 基因组由一条染色体和五个质粒组成。染色体含 5462895 bp，GC 含量 35.5%（GenBank 登录号 CP092833.1）；五个质粒 p370313、p114811、p32860、p11022 和 p10720 分别含 370292、114800、32860、11021 和 10719 bp（GenBank 登录号 CP092834.1 - CP092838.1）。质粒 p32860 含有 mycoidesin 生物合成基因簇，由八个基因组成，编码前体肽（mycA）、2 型羊毛硫肽合成酶（mycM）、含肽酶结构域的 ABC 转运蛋白（mycT）、双组分调节系统（传感器组氨酸激酶mycK和反应调节子mycR）以及与免疫相关的 ABC 转运蛋白（mycE、mycF和mycG）。前体肽 MycA（75 个氨基酸）包含 N 端双甘氨酸型前导肽（40 个氨基酸）和 C 端核心肽（35 个氨基酸），与双组分羊毛硫抗生素 lichenicidin VK21 的前体肽 LchA1 同源性最高（38.10% 同一性）。
3. mycoidesin 的纯化和鉴定：Bacillus mycoides LX30 在 TSB 培养基中培养 10 小时后，经树脂吸附和洗脱得到细菌素粗提物（CE）。HPLC 分析显示，仅保留时间为 17.66 分钟的一个组分对单核细胞增生李斯特菌 ATCC19111 有抗菌活性。MS 分析表明该组分含分子量为 3450.4817 Da（单同位素信号）的纯物质，预测的 MycA 成熟肽 mycoidesin 分子量为 3522.5563 Da，二者相差 72.0746 Da，推测四个氨基酸（两个丝氨酸和四个苏氨酸）发生了脱水反应。LC - MS/MS 进一步分析抗菌物质序列，其碎片与 mycoidesin 相符，证明该抗菌物质即为 mycoidesin，并推断出其一级结构。
4. mycoidesin 的抗菌谱、MIC 和 MBC：mycoidesin 对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌菌株的抗菌活性测试