快速综合细菌进化分析揭示肺炎克雷伯菌基因突变与临床风险：开启细菌研究新视野

《Nature Communications》：Rapid and Integrated Bacterial Evolution Analysis unveils gene mutations and clinical risk of Klebsiella pneumoniae

为解决细菌进化研究难题，研究人员开展肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）进化研究，建立 RIBEA 方法，揭示突变与风险，意义重大。

　　

肺炎克雷伯菌进化研究：突破困境，洞察风险

在微生物的世界里，细菌就像一群不断 “升级打怪” 的小怪兽，持续进化着。自大约 35 亿年前诞生以来，细菌依据达尔文进化论不断演变，与人类展开了一场漫长的 “战争”。致病性和机会性细菌的进化，如获得毒力因子、毒素以及基因突变增强等，严重影响着人类健康。其中，抗菌耐药性（AMR）的出现更是成为全球关注的重大问题，由于获得 AMR 基因和耐药基因突变，细菌变得越来越 “强大”，难以被现有抗菌药物制服。

以往科学家们尝试通过收集临床分离株回顾性地阐明细菌致病机制和 AMR 发展，也有研究人员在队列研究中监测病原体进化。但回顾性分析只能得出推测性结果，队列研究又耗时耗力，无法全面深入地理解细菌进化机制。这就好比在黑暗中摸索，虽然有一丝光亮，但始终无法看清全貌。因此，开发创新方法迫在眉睫，而构建快速分析系统观察细菌进化细节成为解决问题的关键。

肺炎克雷伯菌（Kp）作为引发下呼吸道感染、尿路感染和血流感染的主要病菌，其危害不容小觑。2019 年，超 60 万人因 AMR 相关的 Kp 感染死亡，使其成为 AMR 相关死亡案例中第三大常见菌种。Kp 可分为经典型和高毒力型，高毒力型 Kp 通常呈现高黏液表型（HMV），与侵袭性综合征密切相关。然而，非 HMV-Kp 感染的真实影响和临床进展潜在风险评估却相对不足，且有研究发现非 HMV-Kp 血流感染在病程中易快速产生多重耐药性，这使得对其相关风险的评估变得极为重要。

在这样的背景下，来自日本多所机构（包括札幌医科大学、北海道大学等）的研究人员展开了深入研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。该研究建立了一种快速综合细菌进化分析（Rapid and Integrated Bacterial Evolution Analysis，RIBEA）方法，为揭示细菌进化机制和评估临床风险带来了新的曙光。

研究人员运用了多种关键技术方法。他们从临床样本中分离出 277 株 Kp 菌株，利用肉汤微量稀释法检测抗菌药物敏感性，通过全基因组测序（WGS）确定菌株的基因特征，借助转座子定向测序（TraDIS）在全基因组范围内研究基因功能，构建小鼠肺炎模型进行体内评估，还进行了系列传代实验观察细菌适应性进化。

下面来看具体的研究结果：

1. 非 HMV-Kp 携带高血流感染风险：通过对 Kp 感染病例的 5 年回顾性研究，发现菌血症和 60 天死亡率是免疫抑制患者 Kp 感染的风险因素。在 277 株临床分离株中，HMV 阳性率为 10.5%，且 HMV 分离株未从血液样本中收集到。血清抗性分析表明，超 40% 的分离株具有血清抗性，HMV 和非 HMV 群体间无显著差异。此外，非 HMV 组的基因突变频率显著高于 HMV 组，这意味着非 HMV-Kp 更具基因突变倾向。
2. 构建快速进化菌株：研究人员构建了 mutS 缺失的高突变细菌用于 RIBEA，以非 HMV 菌株 SMKP838 为基础，其 mutS 缺失突变体的突变频率比亲本菌株增加了 824 倍。在系列传代实验中，突变体在第 6 天快速获得血清抗性，第 13 天血清最小抑菌浓度（MIC）达到 72% 并趋于稳定，而野生型菌株 20 天后仍未达到血清抗性阈值。同时，突变体在抗菌药物实验中也快速获得 AMR，这表明 mutS 缺失突变体在环境适应方面具有明显优势。
3. 血清和 AMR 综合分析：研究人员利用 TraDIS 技术，在存在或不存在人血清及肺抗菌物质的环境下培养细菌，通过对比分析确定与血清抗性相关的基因。将 TraDIS 数据与系列传代实验中积累的基因突变数据相结合，最终确定了 7 个与非 HMV-Kp 血清抗性降低相关的基因，如 surA（编码伴侣蛋白）、mrcB（编码青霉素结合蛋白 1B）等，并通过构建基因缺失突变体和等基因突变体进行验证。
4. RIBEA 在非 HMV-Kp 临床分离株中的应用：对随机选择的不同突变频率的非 HMV-Kp 临床分离株进行 20 天系列传代实验，发现高突变频率的临床分离株 SMKP590 最早获得血清抗性和 AMR。通过 WGS 分析，确定了其在传代过程中积累的基因突变，其中 24 个非同义突变与血清抗性相关，且多数基因此前未被报道与血清抗性有关。
5. 快速进化的非 HMV-Kp 菌株的体内评估：在小鼠肺炎模型中，非 HMV-Kp 菌株在免疫抑制小鼠体内可引起肺炎并侵入血液。对比野生型和高突变型菌株感染小鼠的治疗效果，发现高突变型菌株感染小鼠在使用环丙沙星治疗后，肺部和血液中的细菌载量仍较高，且血清抗性和环丙沙星抗性突变体的出现增加了小鼠死亡率，导致更严重的组织损伤，这表明 RIBEA 可用于评估非 HMV-Kp 的临床风险。
6. 高风险非 HMV-Kp 克隆的 RIBEA 评估：针对国际上广泛传播的高风险非 HMV-Kp 克隆（如 ST11 和 ST258），构建了携带 mutS 突变的多药耐药 ST258 突变体。该突变体突变频率大幅增加，3 天内快速获得血清抗性，虽然生长受到一定影响，但在小鼠实验中杀死小鼠的速度明显快于野生型，这表明 RIBEA 能够预测国际分布的高风险多药耐药细菌的临床风险。

在讨论部分，研究人员指出，RIBEA 成功地通过快速细菌进化实验和 TraDIS 技术，筛选出了细菌进化过程中与血清抗性和 AMR 相关的细菌因子和基因突变，发现了一些此前未报道的基因，如 ramA、LOCUS_14270 等。同时，研究还发现人血清对细菌进化的影响大于肺抗菌物质，环境对细菌进化速度起着重要作用。此外，体内评估比体外实验更能准确反映细菌进化的临床风险。但该研究也存在一定局限性，如未考虑外源因子获取和大规模核苷酸变化的影响，未来还需更多随机观察研究和多中心、跨国分析来加强风险因素与临床结果之间的因果关系。

总体而言，RIBEA 为理解细菌进化提供了有力的工具，它能够从众多基因突变中识别出与致病和 AMR 相关的新细菌因子和基因突变，有助于预测感染结果，对临床治疗和细菌生态学研究具有重要意义，为进一步研究细菌进化和开发新的抗菌策略奠定了坚实基础。