新型体外表达液相色谱串联质谱（IVE-LC/MS/MS）技术：mRNA 疫苗多抗原表征的关键利器

《Scientific Reports》：A novel in-vitro expression assay by LC/MS/MS enables multi-antigen mRNA vaccine characterization

在 mRNA 疫苗研发中，传统监测体外表达（IVE）的方法存在局限性。研究人员开展了体外表达液相色谱串联质谱（IVE-LC/MS/MS）测定法的相关研究。结果显示，该方法可多抗原检测且性能良好，有助于深入了解 mRNA 疫苗，推动其研发进程。

　　在现代医学领域，mRNA 疫苗的出现开启了疫苗研发的新篇章。自新冠疫情以来，mRNA 疫苗展现出了强大的应用潜力，其能快速响应病原体变化，有望预防多种传染病，如流感。然而，mRNA 疫苗研发过程中，监测体外表达（IVE）水平至关重要。目前常用的基于流式细胞术（IVE-flow cytometry）的方法，依赖耗时制备的特异性抗体，若病原体菌株发生显著变化，难以快速获得新抗体进行分析，这成为了 mRNA 疫苗研发的一大阻碍。

为解决这一问题，来自美国辉瑞公司（Pfizer Inc）等机构的研究人员开展了深入研究。他们致力于开发、优化并应用一种体外表达液相色谱串联质谱（IVE-LC/MS/MS）测定法，将其作为 IVE-flow cytometry 的正交方法，以实现对 mRNA 转染后细胞中表达的蛋白质抗原进行深入表征，并监测其相对表达水平。相关研究成果发表在《Scientific Reports》上。

研究人员在实验过程中运用了多种关键技术方法。首先是细胞转染与收获技术，使用 HEK293T 细胞，转染特定剂量的 mRNA，培养后进行收获处理；其次是样本制备技术，对细胞进行裂解、还原、烷基化、沉淀、酶解等一系列处理；最后利用液相色谱串联质谱（LC/MS/MS）技术，通过优化参数，实现对目标肽段的高灵敏度、高选择性检测 。

在研究结果部分：

• IVE-LC/MS/MS 方法概述：该方法基于平行反应监测（PRM），通过对细胞材料处理、肽段分析物选择和质谱分析三个关键步骤的优化，实现对目标抗原的检测。在细胞材料处理方面，采用 SDS 处理、超声裂解、还原烷基化、乙腈沉淀等一系列操作，有效裂解细胞并纯化蛋白质；肽段分析物选择遵循特定原则，并通过实验筛选出最佳肽段；质谱分析则选用高分辨率质谱仪，优化流动相流速和电离源等参数，提高检测的灵敏度和选择性。
• 定量方法：研究人员开发了一种无标记相对定量策略，通过计算抗原蛋白肽段信号与 HEK293T 细胞蛋白肽段信号的比值，实现对不同条件下同一抗原蛋白表达水平的比较。同时，该方法还可结合重组蛋白标准品进行绝对定量，进一步提高定量的准确性 。
• 方法开发与性能验证：在不同的液相色谱和质谱条件下对方法进行评估，确定了最佳仪器参数。实验结果表明，该方法具有良好的稳健性、线性和灵敏度。通过对重组蛋白的稀释实验，验证了方法在不同浓度下的可靠性，高分辨率参数能有效消除干扰，提高检测精度。
• mRNA 转染的剂量反应：通过对多价 mRNA 疫苗的剂量反应研究，发现 IVE-LC/MS/MS 和 IVE-flow cytometry 均显示出剂量依赖性的抗原表达。但 IVE-LC/MS/MS 能更准确地量化抗原的绝对丰度，揭示出不同抗原在相同 mRNA 剂量下的真实表达水平，避免了 IVE-flow cytometry 因抗体亲和力等因素导致的误差 。
• mRNA 转染的剂量反应和时间进程：研究发现延长转染时间至 48h 可提高 HA 抗原的产量，且抗原产量随剂量增加而增加，但高剂量（500ng/well）可能导致细胞毒性。同时，HEK 肽段信号可用于标准化细胞颗粒大小的差异，体现了相对定量方法的优势 。
• LNP 稳定性时间进程：通过对四价 mRNA 疫苗 LNP 在不同温度下储存的稳定性研究，发现 - 80°C 储存时，LNP 在 12 个月内保持稳定的表达水平；5°C 储存时，表达水平随时间下降。IVE-LC/MS/MS 和 IVE-flow cytometry 结果趋势相似，证明了两种技术的可靠性 。
• 配方缓冲液对 mRNA 转染的影响：研究不同配方缓冲液对 mRNA 转染的影响时发现，含有 150mM NaCl 的缓冲液可使体外表达提高约 10 倍，表明配方缓冲液对 mRNA 转染效率有显著影响，且 IVE-LC/MS/MS 可有效监测这种影响 。
• LNP 振荡时间对 mRNA 转染的影响：研究发现，LNP 振荡时间对 mRNA 转染效率有影响，30min 振荡对表达影响不明显，240min 振荡则导致抗原表达显著下降，且低浓度 mRNA-LNP 制剂对振荡更为敏感，IVE-LC/MS/MS 比 IVE-flow cytometry 更能检测到这种变化 。

研究结论与讨论部分指出，IVE-LC/MS/MS 方法可同时定量多种抗原，样本制备自动化提高了分析的稳健性和可重复性。该方法在 mRNA 疫苗研究中具有重要意义，能更准确地评估抗原表达水平，为优化 mRNA 疫苗的设计、生产和质量控制提供有力支持。此外，IVE-LC/MS/MS 与 IVE-flow cytometry 技术相互补充，共同推动 mRNA 疫苗的研究与发展，为未来 mRNA 疫苗的广泛应用奠定了坚实基础。