miR-30c-1-3p：调控巨噬细胞自噬，影响结核杆菌生存的关键分子

《Scientific Reports》：Has-miR-30c-1-3p inhibits macrophage autophagy and promotes Mycobacterium tuberculosis survival by targeting ATG4B and ATG9B

结核病（TB）严重威胁人类健康，为探究结核分枝杆菌（MTB）免疫逃逸机制，研究人员以 MTB 感染的巨噬细胞为模型开展研究。结果发现 miR-30c-1-3p 可抑制巨噬细胞自噬、促进 MTB 生存，为抗结核治疗提供了新靶点和诊断标记。

　　结核病（Tuberculosis，TB）是全球十大致死疾病之一，严重威胁人类健康，给发展中国家带来沉重经济负担。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）作为结核病的病原体，能通过多种途径逃避宿主免疫防御，在宿主细胞内长期存活和繁殖。部分感染者会发展为活动性结核病或耐药结核病，因此，阐明 MTB 的免疫逃逸机制、找到关键调控因子，对开发新型抗结核药物意义重大。

自噬（Autophagy）是体内广泛存在的生理过程，在病理状态下可通过降解入侵病原体和有害物质保护宿主。然而 MTB 却能通过调节微小 RNA（microRNA，miRNA）表达来颠覆自噬，从而逃脱宿主防御。此前研究虽发现一些 miRNA 与 MTB 感染相关，但仍有诸多未知等待探索。

为了深入了解 MTB 感染过程中 miRNA 对自噬的调控机制，华中科技大学同济医学院附属武汉中西医结合医院等机构的研究人员开展了相关研究，研究成果发表在《Scientific Reports》上。

研究人员采用了多种技术方法来开展研究。首先，通过 RNA 测序（RNA sequencing，RNA-seq）筛选 MTB 感染巨噬细胞后差异表达的 miRNA，并利用生物信息学分析预测其靶基因。接着，运用实时定量 PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测 miRNA 和靶基因的表达水平。通过 western blot 分析蛋白质表达，免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察自噬相关蛋白的定位和表达情况，透射电子显微镜直接观察自噬溶酶体的数量。此外，构建稳定细胞系过表达相关基因，进行双荧光素酶报告基因实验验证 miRNA 与靶基因的靶向关系，还利用集落形成单位实验（Colony-forming unit assay）评估 MTB 在巨噬细胞内的生存情况。

研究结果如下：

• 差异表达 miRNA 的筛选与验证：研究人员对感染 H37Rv 2 小时的巨噬细胞进行 RNA 测序，发现 14 个差异表达的 miRNA。通过基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，发现这些 miRNA 及其靶基因与自噬过程密切相关。进一步预测和筛选，确定 miR-30c-1-3p 为潜在的自噬通路调节因子，其在感染 2 小时的巨噬细胞中表达下调最为显著，且有自噬相关靶基因 ATG4B 和 ATG9B，因此选择其进行后续研究。
• miR-30c-1-3p 的靶向验证：利用数据库预测发现 ATG4B 和 ATG9B 的 3'-UTR 区域与 miR-30c-1-3p 存在匹配序列。构建双荧光素酶报告载体、GFP 报告载体等实验证实，miR-30c-1-3p 可直接靶向 ATG4B 和 ATG9B 的 mRNA 3'-UTR，抑制其表达。
• MTB 感染过程中相关分子的动态变化：对 MTB 感染不同时间点的巨噬细胞进行 RT-qPCR 检测，发现 miR-30c-1-3p 的表达在感染前 12 小时逐渐升高，之后下降，而 ATG4B 和 ATG9B 的表达趋势与之相反。同时，H37Rv 感染可诱导巨噬细胞产生完整的自噬反应，表现为 LC3-II 蛋白水平升高。
• miR-30c-1-3p 对巨噬细胞自噬的影响：在感染 H37Rv 的巨噬细胞中转染 miR-30c-1-3p mimics，western blot、免疫荧光和透射电子显微镜结果表明，miR-30c-1-3p 可抑制巨噬细胞自噬，减少 LC3-II 蛋白水平、LC3 puncta 数量和自噬溶酶体数量。
• ATG4B 和 ATG9B 对自噬的作用：构建过表达 ATG4B、ATG9B 及两者共过表达的巨噬细胞稳定细胞系，实验表明，过表达 ATG4B 和 ATG9B 可逆转 miR-30c-1-3p 对自噬的抑制作用，且两者共过表达效果更显著，说明 ATG9B 在巨噬细胞自噬中起重要作用。
• miR-30c-1-3p 对 MTB 生存的影响：集落形成单位实验显示，转染 miR-30c-1-3p mimics 的巨噬细胞中 MTB 的生存能力增强，细菌负载增加，表明 miR-30c-1-3p 可促进 MTB 在巨噬细胞内的生存。

研究结论和讨论部分指出，该研究首次揭示了 miR-30c-1-3p 在 MTB 感染过程中抑制自噬的新途径，其通过靶向 ATG4B 和 ATG9B 调节自噬过程，促进 MTB 免疫逃逸。这为开发宿主导向的抗结核治疗提供了有价值的靶点，也为结核病的诊断提供了新的标记物。同时，研究还发现 miR-30c-1-3p 在肿瘤细胞和 MTB 感染中的表达调控机制不同，其具体调节机制尚不完全清楚，有待进一步研究。此外，尽管 miRNA 在 MTB 感染机制研究方面取得了进展，但临床转化治疗仍面临挑战，如 miRNA mimics 的全身应用可能导致免疫毒性等副作用，不过新型药物递送系统有望解决这些问题。未来可构建动物模型结合新型药物递送系统，进一步研究 miR-30c-1-3p 干预的抗结核效果和全身反应。总之，该研究为 MTB 感染的研究提供了新的思路和方向，对推动结核病防治具有重要意义。