发现抗痘苗病毒感染的中和纳米抗体，为正痘病毒防治带来新希望

《Cell Discovery 13.0》：Identification of neutralizing nanobodies protecting against poxvirus infection

为解决正痘病毒感染防治难题，研究人员筛选抗 MPXV 膜蛋白纳米抗体（Nb），发现 M1R-01 可中和 VACV 和 MPXV，有重要意义。

　　论文解读：

在病毒的世界里，正痘病毒家族是一群极具威胁的 “坏家伙”。其中，猴痘病毒（MPXV）原本在非洲地区 “小范围活动”，但 2022 年的新一轮爆发，让它迅速成为全球关注的焦点。截至 2024 年 4 月 30 日，世界卫生组织（WHO）报告了 97208 例实验室确诊病例，还有 186 人不幸死亡 ，8 月更是将其爆发列为 “国际关注的突发公共卫生事件”。曾经用于消灭天花的牛痘疫苗，因为天花疫苗接种计划在 1980 年终止，使得新一代人对 MPXV 和天花病毒（VARV）都缺乏免疫力，面对病毒的侵袭毫无招架之力。

而且，MPXV 感染人体后会引发针对多种病毒膜蛋白的血清 IgG 反应。正痘病毒的膜蛋白种类繁多且功能复杂，是疫苗开发和抗病毒治疗的重要靶点。不过，目前针对正痘病毒的有效抗体疗法研究困难重重，病毒膜蛋白的多样性和病毒入侵机制的复杂性成了 “拦路虎”。

在这样的背景下，中国医学科学院病原生物学研究所的研究人员勇敢地接受挑战，开展了一项意义重大的研究。他们成功制备了 6 种 MPXV 包膜蛋白，这些蛋白相对保守，在中和过程中可能发挥重要作用。研究人员利用合成纳米抗体（Nanobody，Nb）文库，筛选出了一系列针对这些病毒蛋白的特异性 Nb，并发现了一种名为 M1R-01 的交叉反应性 Nb，它能有效中和痘苗病毒（VACV）和 MPXV。更令人惊喜的是，基于 M1R-01 的抗体策略在小鼠实验中，对致命的 VACV 攻击提供了最佳保护。研究人员还测定了 M1R-Nb 复合物的晶体结构，揭示了 M1R-01 的新颖结合特性和详细的构象表位信息 。这一研究成果发表在《Cell Discovery》上，为正痘病毒感染的治疗和预防提供了有前景的候选方案。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：一是利用噬菌体展示技术从合成的 Nb 文库中筛选特异性 Nb；二是通过表面等离子体共振（SPR）技术评估 Nb 与靶蛋白的结合亲和力；三是采用结晶和结构测定技术解析 M1R-Nb 复合物的晶体结构；四是借助动物实验，在小鼠模型中评估抗体的保护效果。

下面来看看具体的研究结果：

1. 选定 MPXV 膜蛋白的保守性分析和制备：研究人员根据病毒膜蛋白的功能，选定了 6 种 MPXV 膜蛋白进行研究，包括 A29L、H3L、E8L、M1R、B6R 和 A35R。通过结构比较发现，这些蛋白在 MPXV 和 VACV 之间具有高度的结构保守性，但序列相似性存在差异。随后，成功构建表达质粒并纯化出这 6 种蛋白，为后续的 Nb 筛选奠定了基础。
2. 靶向 MPXV 膜蛋白的中和 Nb 筛选：利用合成的多样化 Nb 噬菌体展示文库平台，经过四轮筛选和噬菌体 ELISA 验证，分离出针对不同膜蛋白的 Nb。评估这些 Nb 对 VACV 的中和效力时发现，大多数 Nb 中和效力低于 30% ，但 M1R-01 等 8 种 Nb 的中和效力达到 40% 或更高，其中 M1R-01 中和活性最高，接近 70%。将部分 Nb 与小鼠 IgG2a-Fc 融合后，只有 Fc-M1R-01 的中和活性显著提升，超过 98%。
3. 多价 Nb 的亲和力和中和作用提升：为增强 M1R-01 的效力，研究人员构建了二价（BiM1R-01）和三价（Tri-M1R-01）变体。SPR 分析显示，多价变体的亲和力显著增强，Tri-M1R-01 和 mFc-M1R-01 的 KD 值分别为 1.05 nM 和 1.79 nM，相比单价 M1R-01 提高了 20 - 40 倍。中和实验表明，多价变体的中和活性也明显提高，Tri-M1R-01 和 mFc-M1R-01 对 VACV 的中和水平超过 90%，对 MPXV 也有一定的中和能力。
4. 鼻内给予 Tri-M1R-01 对小鼠 VACV 感染的保护作用：在小鼠预防保护实验中，鼻内给予 Tri-M1R-01 的小鼠在感染致命剂量的 VACV-WR 后，体重变化较小且无死亡现象，脾脏重量和病毒载量明显降低，肺组织病变也显著减轻，表明 Tri-M1R-01 能有效抑制病毒复制和传播。
5. 腹腔注射 Fc-M1R-01 对小鼠致命 VACV 攻击的保护作用：通过腹腔注射实验评估 Fc-M1R-01 的治疗潜力，结果显示，注射 Fc-M1R-01 的小鼠在感染 VACV 后体重稳定，脾脏与体重比无明显差异，血液和肺组织中的病毒载量极低，肺组织病变减轻，证明 Fc-M1R-01 能有效抑制 VACV 复制和疾病进展。
6. M1R-01 与 M1R 复合物的晶体结构：测定 M1R 和 M1R-01 的复合物晶体结构发现，M1R-01 通过三个互补决定区（CDRs），尤其是延长的 CDR3，与 M1R 上的特定区域结合，形成了较大的埋藏表面积（BSA），达到 1129.5 ?2 ，存在大量相互作用，其中 CDR3 区域贡献最大。
7. M1R-01 的结合表位与其他抗体不同且在正痘病毒中保守：研究人员将针对 M1R/L1R 的抗体分为三类，M1R-01 属于 II 类，其结合表位与 7D11 等 I 类抗体不同，且不重叠。对 11 种正痘病毒株的 M1R 同源物进行氨基酸序列比对发现，M1R-01 识别的表位在不同病毒株中高度保守，表明其具有广谱抗病毒潜力。
8. M1R-01 在病毒结合后阶段发挥中和作用：通过构建突变体和相关实验发现，M1R 和 M1R-01 上的多个关键残基参与了相互作用，且主要集中在 M1R-01 的 CDR3 区域。病毒进入实验表明，M1R-01 在病毒结合后阶段发挥中和作用，在病毒附着阶段添加 M1R-01 对病毒在细胞表面的丰度影响不大，但在结合后阶段添加能显著减少病毒噬斑形成。

研究结论和讨论部分指出，该研究成功制备了 6 种 MPXV 保守膜蛋白，筛选出 M1R-01，它能有效中和 VACV 和 MPXV，并在小鼠模型中展现出强大的保护作用。结构分析揭示了 M1R-01 独特的结合特性和表位信息，为开发新型免疫策略奠定了基础。不过，MPXV 对中和抗体的敏感性低于 VACV，目前缺乏稳定可靠的 MPXV 小鼠模型，未来需要进一步研究 M1R-01 在 MPXV 中和及治疗干预中的作用机制和疗效。总的来说，这项研究为正痘病毒感染的防治提供了新的方向和潜在的治疗方案，具有重要的科学意义和临床应用价值。