N1C VARIANT 指南：开启罕见遗传病反义寡核苷酸（ASO）精准治疗新时代

《AJHG》：Consensus guidelines for assessing eligibility of pathogenic DNA variants for antisense oligonucleotide treatments

本文介绍 N1C VARIANT 指南，助评估致病 DNA 变异对 ASO 治疗的适用性，推动罕见病精准治疗。

　　### 引言
目前已知约 7000 种罕见病，仅约 5% 有改善病情的治疗方法。罕见病是指在美国影响不到 20 万人、在欧洲和加拿大影响不到 1/2000 人的疾病，全球约 6% 的人口受罕见病困扰，多数罕见病由遗传因素引起。随着遗传诊断技术进步，能诊断出近 50% 的罕见病患者，但针对这些疾病的靶向治疗需求迫切。由于许多罕见病患者数量少，常规药物研发途径不可行，需要定制化治疗策略。

反义寡核苷酸（ASO）是一种有前景的基因疗法。美国食品药品监督管理局（FDA）、欧洲药品管理局（EMA）等已批准 20 多种寡核苷酸疗法，其可全身或局部给药，且半衰期有限，需重复给药，但能根据个体情况调整治疗方案。ASO 用途广泛，可下调毒性功能获得（GoF）和显性负性变异的转录本，恢复截短变异导致的功能丧失（LoF）效应的阅读框，纠正异常剪接，增加单倍体不足（HI）相关疾病中野生型（WT）等位基因的蛋白质表达。不过，并非所有遗传变异都适合 ASO 治疗，需系统评估每个致病 DNA 变异对 ASO 治疗的适用性。

自 2018 年起，多个团队为患者开发定制化 ASO 治疗，截至 2025 年 1 月，已知 27 人接受了个性化 ASO 治疗，更多正在研发中。N=1 协作组（N1C）致力于开发超罕见 “n = 1 / 少数” 疗法的最佳实践，促进罕见病患者安全、公平地获得治疗。其患者识别工作组（PIWG）专注于确定适合 ASO 开发的遗传变异、适合基因治疗的疾病以及适合个性化基因治疗开发的个体。个性化 ASO 疗法开发分三个阶段，评估个体是起始步骤，基于遗传变异的分子适用性、疾病评估和个体评估三个主要方面。为协助确定 ASO 开发的优先顺序，PIWG 制定了评估诊断 DNA 变异对 ASO 疗法适用性的标准和共识，即 N1C VARIANT（variant assessments toward eligibility for antisense oligonucleotide treatment）指南。

指南和资源开发

• 指南开发概述：N1C VARIANT 指南的开发是多站点协作的成果，融合了研究人员和遗传学医疗服务提供者的意见。经过多轮修订和试点，最终形成 1.0 版本。
• 版本 0.1：PIWG 内部先对样本变异进行评估，来自四个参与站点的评估人员独立评估 30 个选定变异，之后比较评估方法和结果，形成指南大纲。大纲确定了指南的目的、内容、格式和分类定义，经 PIWG 成员反馈修订后，起草了 0.1 版本。该版本仅适用于导致常染色体隐性和 X 连锁隐性疾病的基因中的 LoF 变异，且仅评估外显子跳跃和剪接校正 ASO 的变异。随后，该草案在 PIWG 内共享收集反馈，并与外部志愿者分享，志愿者对三个测试变异进行评估。
• 版本 0.2：收集外部志愿者的反馈和评估结果，对指南进行进一步修订，形成 0.2 版本。再次在 PIWG 内分享编辑，之后分发给更多外部志愿者，对 12 个测试变异进行第二轮试点评估，收集反馈用于再次修订。
• 版本 0.3：0.3 版本扩展了指南内容，纳入了对 GoF 和显性负性变异的 ASO 或小干扰 RNA（siRNA）介导的转录本敲低以及 WT 等位基因上调（如靶向增强核基因输出（TANGO））的适用性评估，还涵盖了其他遗传模式（不包括线粒体遗传）。修订后的指南与 19 名外部志愿者分享，进行第三轮试点评估，评估 15 个测试变异，最终版本在提交前与所有共同作者分享收集最终反馈。
• 测试变异整理：所有测试变异由 PIWG 一名未参与评估的成员选择，来源为已发表文献或 ClinVar 数据库。两名 PIWG 成员独立评估每个变异，根据公开信息确定评估可行性，并起草 “正确答案”，评估后将答案及解释传达给志愿者评估人员。
• 指南试点：志愿者评估人员包括研究生、临床遗传学和 ASO 疗法开发领域不同经验水平的教师、基础科学或转化研究人员、遗传咨询师和临床医生，通过 N1C 的专业网络招募。
• 视频示例开发：制作了短视频提供选定测试集变异的评估示例，视频在 Microsoft PowerPoint 上设计和录制，经 PIWG 和志愿者评估人员审查。视频中讨论的变异由 PIWG 成员选择，来源为已发表文献或 ClinVar 数据库，部分已有开发的 ASO。确定变异分析和分类后，录制分析步骤和预期分类，视频可在 N1C YouTube 频道和网站上获取。
• N1C 变异适用性计算器开发：开发了交互式决策树（N1C 变异适用性计算器）辅助应用指南。先编写基于指南的问题和答案目录，借助 ChatGPT 编写 HTML 和 Javascript 代码，部署在 N1C 网站上，代码在 N1C 的 GitHub 页面公开。计算器经多位共同作者测试，收集反馈并完善。
• 野生型等位基因上调表：N1C VARIANT 指南评估 WT 等位基因上调时参考多个资源。为辅助评估，整合了相关论文的结果，形成一个 Excel 文件，包含基因的 pLI 评分、ClinGen HI 评分，并注释了相应的反义转录本。

结果

• 指南目的：N1C VARIANT 指南用于评估（可能）致病 DNA 变异对 ASO 治疗的适用性和优先级。评估人员可借助指南识别最可能从 ASO 疗法中获益的遗传变异，区分适合和不适合的变异。指南考虑了个体的遗传诊断、疾病和遗传变异的分子机制，为罕见遗传病领域的专业人员提供分析和分类致病变异对 ASO 疗法适用性的框架。评估人员可借此识别适合评估的致病变异，评估变异对 ASO 介导的剪接校正、外显子跳跃、转录本敲低的适用性，对变异进行分类，并考虑 HI 情况下 WT 等位基因的上调策略。不过，全面评估个体是否适合 ASO 疗法还需考虑疾病和个体特定的临床因素，这超出了该指南的范围。
• 指南结构：评估特定变异时，仅部分指南内容相关。指南引导读者逐步核实变异注释、遗传模式和致病机制，若关键信息缺失则判定变异无法评估；若信息完备，可确定适用的 ASO 策略，如剪接校正、规范外显子跳跃、RNA 敲低或 WT 等位基因上调，之后借助流程图深入评估变异对特定策略的适用性，指南中还提供了辅助评估的公开资源。评估人员还应检查针对特定变异、外显子或疾病是否已有 ASO 开发，指南提供了确定功能性 ASO 的标准和搜索资源及术语。评估结束后，可根据收集的信息对变异对剪接校正、外显子跳跃和 RNA 敲低的适用性进行分类，对于 WT 等位基因上调，指南提供了策略和相关考虑，但未定义适用性分类，还提供了一个 Excel 表格辅助综合评估多种 WT 等位基因上调方法。
• 分类术语：为规范评估，指南定义了五级分类模式：符合（eligible）、可能符合（likely eligible）、不太可能符合（unlikely eligible）、不符合（not eligible）和无法评估（unable to assess）。符合的变异有功能证据支持 ASO 方法的有效性；不符合的变异特定 ASO 治疗方法不可行；可能符合的变异基于分子标准有潜在靶向可能，但缺乏功能证据；不太可能符合的变异分子标准提示 ASO 可能无效，但无直接功能证据否定；无法评估的变异要么不适用指南，要么信息不足无法评估。
• 培训视频：发布时已创建并分享 12 个培训视频，为评估人员提供逐步指导，突出关键资源和评估技术，每个视频展示对特定变异的评估及独特结果，可在 N1C YouTube 频道观看。
• 变异适用性计算器：N1C 变异适用性计算器辅助评估，引导评估人员按 N1C VARIANT 指南 1.0 版本逐步操作，无法跳过问题提示，促使评估人员在评估前深入研究基因或变异。计算器考虑变异类型，引导用户进入相关指南章节，可跟踪评估过程，生成问题和答案打印件，便于理解分类和发现错误。
• 指南维护：PIWG 每年对指南进行审查，确保其反映 ASO 技术的最新进展。审查时更新指南，纳入新工具、数据库和网站，根据新知识调整内容。更新后的指南经 PIWG 成员审查后发布，同时更新培训材料、视频和适用性计算器。若有科学突破需要立即更改评估流程，PIWG 会进行非计划更新。PIWG 不断发展，成员多元化，定期修订保证分析与时俱进。

讨论

本文介绍了 N1C VARIANT 指南 1.0 版本，包括其开发和达成共识的过程，以及辅助变异评估的培训材料和工具。该指南是评估单基因疾病致病 DNA 变异对 ASO 疗法潜在适用性的国际共识方法，随着个性化基因疗法的发展，有望让更多罕见病患者受益。

开发指南的迭代过程表明，熟悉评估程序需要时间，评估致病变异对 ASO 治疗的适用性需综合考虑多个方面，且需要实践。指南提出的五级分类模式中，“可能符合” 和 “不太可能符合” 的分类具有挑战性，未来需进一步细化。随着技术进步和知识增长，部分变异对特定 ASO 方法的分类可能改变，评估时应审慎阅读文献，评估 ASO 治疗的方法和功能数据。

目前 ASO 的开发和临床测试有限，并非适用于所有变异类型、致病机制和遗传模式，本指南是基于 PIWG 成员所在站点自 2018 年评估约 1500 个变异的经验以及成员在人类分子遗传学和 ASO 设计开发方面的专业知识制定的。尽管在不同专业背景的评估人员中测试了指南，但在不同医疗环境中的应用可能还需进一步调整和完善。

虽然特定变异对 ASO 治疗策略的适用性是个性化基因疗法开发的重要第一步，但疾病和个体特定因素同样关键，如症状的可逆性和严重程度等，这些因素的评估超出了本指南范围，需要额外的建议。理想情况下，希望将适用性评估整合到临床实践中，为罕见遗传病患者提供诊断和治疗信息。借助提供的培训材料和测试变异，临床遗传学家和实验室及诊断中心的专业人员可进行自我培训成为评估人员，长远来看，期望实现指南和评估程序的自动化，根据致病变异为个体提供最佳治疗策略分析。

数据和代码可用性

变异评估和 WT 等位基因上调方法的数据可在相关表格和文件中获取，原始数据来自多篇论文。开发过程中生成的代码在 GitHub 上以开源 AGPL 许可证发布。

致谢

感谢 N1C 其他成员在指南开发中的帮助，特别感谢 Nicole Nolen 在 N1C 网站上提供培训材料和工具的支持，也感谢多年来提供遗传诊断信息的家庭和临床医生。本研究得到多个机构和项目的支持。

作者贡献

N1C PIWG 的 D.C. 和 M.C.L. 构思了 N1C VARIANT 指南，起草了指南和手稿，进行评估轮次，评估和整合反馈。D.C. 制作示例视频，M.C.L. 选择测试变异，开发变异适用性计算器。其他 PIWG 成员参与指南审查、编辑手稿和视频反馈，部分成员还参与变异评估培训。还有众多人员作为评估人员提供反馈，部分人员参与特定工作，如制作 WT 等位基因上调表、测试变异适用性计算器等。作者按特定顺序列出，D.C. 和 M.C.L. 分别为第一和资深作者。

利益声明

作者声明无利益冲突。