综述：CRISPR 技术在癌症研究与治疗中的应用

《TRENDS IN Pharmacological Sciences》：CRISPR/Cas technologies for cancer drug discovery and treatment

本文聚焦 CRISPR 技术，阐述其在癌症研究各方面的作用及临床应用前景与挑战。

　　

CRISPR 技术在癌症研究与治疗中的应用

一、引言

成簇规律间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）及其相关蛋白（CRISPR - associated protein，Cas）组成的基因编辑系统，是生命科学领域的一项重大突破。这一技术能够对 DNA 和 RNA 进行精准编辑，极大地推动了基因型 - 表型关系的研究，在细胞和基因治疗方面也展现出巨大潜力。在肿瘤学领域，CRISPR/Cas 技术的应用尤为广泛，从基础研究到临床前治疗策略的探索，都发挥着重要作用。本文将对 CRISPR 技术在癌症研究与治疗中的相关进展进行综述。

二、CRISPR/Cas 系统概述

CRISPR/Cas 系统是细菌和古菌的一种适应性免疫系统，通过识别并切割外来的核酸序列，保护自身免受噬菌体等病原体的侵害。在基因编辑领域，常用的有 CRISPR/Cas9、Cas12 和 Cas13 等系统。其中，CRISPR/Cas9 系统由 sgRNA（single guide RNA）和 Cas9 蛋白组成。sgRNA 能够引导 Cas9 蛋白识别并结合到特定的 DNA 序列上，Cas9 蛋白则发挥核酸内切酶的活性，切割 DNA 双链，造成双链断裂（Double - Strand Break，DSB）。细胞在修复 DSB 的过程中，会发生非同源末端连接（Non - Homologous End Joining，NHEJ）或同源重组（Homologous Recombination，HR），从而实现基因的敲除、插入或替换等编辑操作。Cas12 和 Cas13 等系统也具有各自独特的功能，Cas12 除了能切割双链 DNA 外，还具有对单链 DNA 的非特异性切割活性；Cas13 则主要用于靶向 RNA，实现 RNA 的编辑或降解。

三、CRISPR/Cas 技术在癌症研究中的应用

（一）癌症模型的构建

癌症的发生发展是一个复杂的多阶段过程，涉及多个基因的改变。传统的癌症模型构建方法存在一定的局限性，而 CRISPR/Cas 技术为构建更精准、更接近临床实际的癌症模型提供了有力工具。利用该技术，可以在细胞系、类器官和小鼠模型中精确模拟癌症相关基因突变。例如，在细胞系中，通过 CRISPR/Cas9 敲除特定的抑癌基因，可建立具有肿瘤细胞特征的细胞模型，用于研究肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等特性。在小鼠模型构建方面，CRISPR/Cas 技术能够实现多基因编辑，模拟人类癌症的复杂基因组变化。将携带特定 sgRNA 和 Cas9 的病毒载体导入小鼠胚胎干细胞或受精卵中，可获得带有特定基因突变的转基因小鼠，这些小鼠模型可用于研究癌症的发生发展过程、肿瘤微环境的相互作用以及评估潜在的治疗策略。

（二）肿瘤演化研究

肿瘤在发展过程中会不断发生进化，产生异质性，这是癌症治疗面临的一大挑战。CRISPR/Cas 技术有助于深入理解肿瘤演化机制。通过在肿瘤细胞中引入可诱导的 CRISPR/Cas 系统，可以在不同时间点对特定基因进行编辑，模拟肿瘤发展过程中的基因变化。研究人员可以观察肿瘤细胞在基因编辑后的表型变化，如细胞增殖速度、对化疗药物的敏感性等，从而追踪肿瘤细胞的演化轨迹。此外，结合单细胞测序技术，能够在单细胞水平上分析肿瘤细胞的基因组变化，揭示肿瘤细胞的异质性和克隆演化过程。这对于了解肿瘤的耐药机制、制定个性化治疗方案具有重要意义。

（三）癌症相关基因的鉴定

1. 寻找肿瘤生长相关基因：CRISPR/Cas 筛选技术是鉴定癌症相关基因的重要手段。通过构建针对全基因组或特定基因集的 sgRNA 文库，将其导入肿瘤细胞系中，利用 CRISPR/Cas 系统对基因进行大规模敲除或干扰。经过筛选，能够在细胞增殖、存活等方面表现出显著差异的基因，很可能是与肿瘤生长密切相关的基因。例如，在某些癌细胞系中，通过 CRISPR/Cas 筛选发现了一些之前未被报道的基因，这些基因的敲除会显著抑制肿瘤细胞的生长，进一步研究证实它们在肿瘤细胞的代谢、信号传导等关键通路中发挥重要作用。
2. 探究化疗敏感性和耐药性相关基因：化疗是癌症治疗的重要手段之一，但肿瘤细胞对化疗药物的耐药性严重影响了治疗效果。CRISPR/Cas 技术可用于寻找与化疗敏感性和耐药性相关的基因。在化疗药物处理的肿瘤细胞中进行 CRISPR/Cas 筛选，能够鉴定出那些敲除后可使肿瘤细胞对化疗药物敏感性增加或降低的基因。这些基因可能参与药物转运、代谢、DNA 损伤修复等过程，通过对它们的研究，可以深入了解化疗耐药机制，为开发克服耐药性的新策略提供靶点。

四、CRISPR/Cas 技术在癌症治疗中的应用

（一）工程化免疫细胞治疗

1. 嵌合抗原受体 T 细胞（CAR - T 细胞）的构建：CAR - T 细胞治疗是近年来肿瘤免疫治疗领域的一项重大突破。传统的 CAR - T 细胞制备过程中，存在一些限制因素，如脱靶效应、细胞因子释放综合征等。CRISPR/Cas 技术为优化 CAR - T 细胞的制备提供了新途径。利用 CRISPR/Cas9 可以精确敲除 T 细胞内的某些基因，如 T 细胞受体（T Cell Receptor，TCR）基因，减少移植物抗宿主病（Graft - versus - Host Disease，GVHD）的发生风险；同时，还可以在 T 细胞中插入编码 CAR 的基因，使其表达特异性识别肿瘤抗原的 CAR。通过这种精准编辑，能够提高 CAR - T 细胞的靶向性和安全性，增强其抗肿瘤效果。
2. 自然杀伤（NK）细胞和巨噬细胞的工程化改造：除了 CAR - T 细胞，NK 细胞和巨噬细胞在肿瘤免疫治疗中也具有重要潜力。CRISPR/Cas 技术可用于对 NK 细胞和巨噬细胞进行工程化改造。例如，通过敲除 NK 细胞中的某些抑制性受体基因，增强 NK 细胞对肿瘤细胞的杀伤活性；对巨噬细胞进行基因编辑，使其表达特定的细胞因子或受体，提高其吞噬肿瘤细胞的能力。这些工程化的免疫细胞有望成为新一代的癌症治疗药物。

（二）精准抗癌基因编辑治疗

CRISPR/Cas 系统可以作为直接的抗癌药物，通过靶向肿瘤细胞中的关键致癌基因或肿瘤支持基因，实现对癌细胞的精准杀伤。例如，针对驱动肿瘤发生发展的癌基因，如 BRAF^V600E突变基因，设计特异性的 sgRNA，引导 Cas9 蛋白切割该突变基因，从而抑制癌细胞的增殖。此外，肿瘤细胞的生长和存活依赖于一些肿瘤支持基因，如参与肿瘤血管生成、细胞外基质重塑的基因。利用 CRISPR/Cas 技术敲除这些基因，可以破坏肿瘤细胞的微环境，抑制肿瘤的生长和转移。同时，CRISPR/Cas 系统还可以与遗传电路相结合，构建智能抗癌系统。根据肿瘤细胞内特定的基因表达或代谢状态，启动遗传电路，激活 CRISPR/Cas 系统，靶向切割肿瘤相关基因，实现对癌细胞的特异性清除。

五、CRISPR/Cas 技术临床转化面临的挑战

尽管 CRISPR/Cas 技术在癌症研究和治疗方面取得了显著进展，但从实验室到临床应用仍面临诸多挑战。

（一）脱靶效应

脱靶效应是 CRISPR/Cas 技术面临的主要问题之一。虽然 sgRNA 能够引导 Cas9 蛋白靶向特定的 DNA 序列，但在实际应用中，Cas9 蛋白可能会在基因组的其他位点发生非特异性切割，导致脱靶突变。这些脱靶突变可能会影响正常基因的功能，引发潜在的安全风险，如致癌风险增加等。目前，研究人员正在通过优化 sgRNA 的设计、开发高保真的 Cas9 蛋白变体等方法来降低脱靶效应，但仍需要进一步研究以确保其在临床应用中的安全性。

（二）递送难题

将 CRISPR/Cas 系统高效递送至靶细胞是实现临床治疗的关键步骤。目前常用的递送载体包括病毒载体和非病毒载体。病毒载体虽然具有较高的转染效率，但存在免疫原性、潜在的致癌风险等问题；非病毒载体如脂质体、聚合物等，虽然安全性较高，但递送效率相对较低。此外，如何实现 CRISPR/Cas 系统在体内的靶向递送，确保其能够准确到达肿瘤细胞，也是一个亟待解决的问题。开发更安全、高效的递送系统，提高 CRISPR/Cas 系统的递送效率和靶向性，是实现其临床转化的重要前提。

（三）伦理和监管问题

CRISPR/Cas 技术的强大基因编辑能力引发了一系列伦理和监管问题。在癌症治疗中，对人类生殖细胞进行基因编辑可能会带来不可预测的后果，引发严重的伦理争议。此外，如何确保 CRISPR/Cas 技术在临床应用中的规范性和安全性，需要建立完善的伦理审查机制和监管体系。国际社会和各国政府都在积极制定相关的伦理准则和法规，以规范 CRISPR/Cas 技术的研究和应用，确保其在符合伦理和法律的框架内发展。

六、结论

CRISPR/Cas 技术作为一项革命性的基因编辑技术，在癌症研究和治疗领域取得了令人瞩目的成果。它为癌症模型的构建、肿瘤演化机制的研究以及癌症相关基因的鉴定提供了强大的工具，同时在癌症治疗方面展现出巨大的潜力，包括工程化免疫细胞治疗和精准抗癌基因编辑治疗等。然而，要实现 CRISPR/Cas 技术在临床癌症治疗中的广泛应用，还需要克服脱靶效应、递送难题以及伦理和监管等诸多挑战。随着技术的不断改进和完善，相信在未来，CRISPR/Cas 技术将为癌症患者带来更有效的治疗方案，为攻克癌症这一重大疾病带来新的希望。在基础研究方面，深入探索 CRISPR/Cas 系统的作用机制，进一步优化其编辑效率和特异性，将为其临床应用提供更坚实的理论基础。在临床研究方面，加强对 CRISPR/Cas 技术安全性和有效性的评估，积极开展临床试验，积累更多的临床数据，将有助于推动该技术从实验室走向临床实践。同时，跨学科的合作也至关重要，生命科学、医学、材料科学、工程学等多学科的协同创新，将为解决 CRISPR/Cas 技术临床转化过程中的难题提供新的思路和方法。