综述：电子传递链的创新驱动古菌甲烷代谢

《TRENDS IN Biochemical Sciences》：Innovations in the electron transport chain fuel archaeal methane metabolism

该综述聚焦产甲烷古菌电子传递链（ETC），阐述其在甲烷代谢中的创新、功能及对环境的影响。

　　### 多样的能量守恒途径与甲烷生成相关
产甲烷古菌是一类主要栖息于缺氧或微氧环境的古菌，在其能量代谢过程中会产生甲烷这一副产物。甲烷生成是一种特殊的代谢方式，涉及一系列与能量守恒相偶联的单碳转化反应。产甲烷古菌产生的甲烷在全球甲烷收支中占比可观，因此，无论是从缓解温室气体效应，还是作为未来可持续生物经济的能源角度出发，深入了解甲烷生成机制都至关重要。尽管几十年前就已确定了将 CO₂或有机化合物转化为甲烷的相关酶，但能量守恒的具体细节仍未完全明晰。

产甲烷古菌在能量守恒方面融合了发酵和呼吸的经典模式。它们会产生一种内源性有机末端电子受体 —— 辅酶 M（CoM-SH）和辅酶 B（CoB-SH）的异二硫化合物（HDS），这一过程与发酵类似，HDS 在甲基辅酶 M 还原酶（MCR）催化的甲烷生成最后一步产生。不过，产甲烷古菌核心产甲烷途径的底物水平步骤并不产生 ATP，而是像呼吸作用一样，依靠由离子动力势（IMF）驱动的膜结合 ATP 合酶来合成 ATP。不同产甲烷古菌谱系生成 IMF 的方式有所差异，部分依赖膜结合的钠转运甲基转移酶，而另一些则借助电子传递链（ETC）。

许多产甲烷古菌，如甲烷杆菌门以及盐杆菌门中的甲烷微菌纲和甲烷胞菌纲的部分成员，缺乏膜结合电子载体和 ETC。这些古菌底物范围较窄，通常使用有限的电子供体（主要是氢气（H₂），有时也会利用甲酸、乙醇等）将二氧化碳（CO₂）还原为甲烷 。在这类产甲烷古菌中，一种名为 N⁵- 甲基 - H₄MPT:CoM-SH 甲基转移酶（MTR）的钠泵膜相关酶用于生成 IMF。MTR 催化甲基从单碳载体四氢甲烷蝶呤（H₄MPT）转移至 CoM-SH，同时泵出 2 个 Na⁺离子，这些离子可被 Na⁺或 H⁺依赖的 ATP 合酶用于能量守恒。与具有 ETC 的产甲烷古菌相比，这类古菌通常倍增时间更快，但生长产量较低。

少数产甲烷古菌谱系（盐杆菌门中的甲烷八叠球菌纲和甲烷嗜盐碱菌纲）编码细胞色素和 ETC，这使得它们能够利用甲醇、甲胺和乙酸等有机化合物，通过底物歧化作用进行生长，无需外部电子供体（如 H₂）来驱动甲烷生成。在具有 ETC 的产甲烷古菌中，通常存在三种可溶性电子载体：CoB-SH、辅酶 F₄₂₀（F₄₂₀）和一类称为铁氧还蛋白（Fds）的小型铁硫蛋白。产甲烷古菌的 ETC 兼具新颖性和保守性，每个生物能复合物都有进化创新，以与这些独特的电子载体相互作用，并在接近生命热力学阈值的条件下优化能量守恒。ETC 可分为一个或多个输入模块和一个输出模块，输入模块是氧化还原辅因子的电子进入 ETC 的入口，输出模块则将电子从 ETC 转移至 HDS。输入模块会因菌株和生长底物的不同而有很大差异，但输出模块始终不变，因为末端电子受体始终是 HDS。

产甲烷古菌 ETC 中的铁氧还蛋白输入模块

Rnf 复合物（RNF）最初在荚膜红细菌中被发现，它为固氮提供低电位电子，在此过程中，NADH + H⁺用于生成还原型 Fd（Fd_red），理论上每转移两个电子会转运约 2 个 Na⁺。在其他细菌中，RNF 可逆转该反应以生成 IMF 。在产甲烷古菌中，RNF 是一个假定的能量守恒位点，它将产甲烷过程中生成的 Fd_red的氧化与膜结合电子载体（如甲烷八叠球菌属中的甲烷吩嗪（MP））的还原相偶联。与细菌相比，产甲烷古菌中 RNF 理论上转运的钠离子数量约为细菌的两倍（每两个电子约 4 个 Na⁺），但实际实验中，利用乙酸甲烷八叠球菌的反转膜泡进行检测，每两个电子仅转运 0.04 个 Na⁺，这可能是由于使用了非天然 Fd，也可能是 Na⁺/H⁺反向转运体的存在影响了分析结果。未来对缺乏多亚基钠 / 质子反向转运体（Mrp）或其他类似蛋白的突变体膜的研究，将有助于更准确地了解产甲烷古菌中 Rnf 的离子转运化学计量。

产甲烷古菌的 Rnf 复合物含有一个新型的多血红素 c 型细胞色素（MHC）亚基 MmcA，它介导电子向 MP 转移的最后一步，电子流经 MmcA 还可能促进细胞与细胞外电子受体的呼吸作用，但目前尚未证实产甲烷古菌在这种条件下能持续生长。有趣的是，RNF 大多由缺乏氢营养型生长能力的产甲烷古菌编码，不过也有例外，如淡水产甲烷古菌湖沼甲烷八叠球菌，它同时编码 RNF 和完整的氢化酶，能够利用 H₂ + CO₂生长，这为研究环境驱动的选择如何影响产甲烷古菌 ETC 的组成提供了理想的平台。

缺乏 RNF 的产甲烷古菌会利用膜结合的 Ech 复合物（ECH）来氧化产甲烷过程中生成的 Fd_red。ECH 对 Fd_red的氧化是一个放能反应，该反应与至少一个质子跨膜泵送相偶联。ECH 在细胞内生成的 H₂会迅速扩散到细胞质膜外，被另一种膜结合氢化酶（紫精反应性氢化酶二（VHT））氧化，这一过程称为氢循环。氢循环最初在硫酸盐还原细菌中被提出，在产甲烷古菌中，氢循环的作用存在争议，除 ECH 外，一些缺乏 ETC 的产甲烷古菌中也进化出了与 Fd 相互作用的膜结合氢化酶，这些氢化酶可能消耗 H₂为合成代谢反应提供低电位电子。

产甲烷古菌 ETC 中的辅酶 F₄₂₀输入模块

几乎所有具有 ETC 的产甲烷古菌（除甲烷嗜盐碱菌纲外）都编码 Fpo 复合物（FPO），FPO 是细菌和线粒体 ETC 中复合物 I 的同源物。与复合物 I 不同，FPO 含有一个新型亚基 “头部”（FpoF），用于催化产甲烷过程中生成的还原型 F₄₂₀（F₄₂₀H₂）的氧化，并将其与 MP 的还原相偶联。理论上，FPO 催化的反应每转移两个电子可泵送两个质子，约为 “经典” 复合物 I 泵送质子数的一半。FPO 有一个独特的亚基 FpoO，它具有预测的 2Fe - 2S 结合位点，可能在复合物 “头部” 的电子从 F₄₂₀转移至 MP 的过程中发挥作用，未来对 FPO 的结构研究和 FpoO 的基因必需性测试，将有助于明确该亚基在电子流中的作用。一些产甲烷古菌编码的 FPO 缺乏真正的 FpoF 亚基，这种 “无头” FPO 存在于专性乙酸裂解产甲烷古菌中，有研究认为它可能是 Fd_red的输入模块，但仍需严格的体外生化验证。总体而言，FPO 是一个模块化的生物能复合物，在产甲烷古菌中虽广泛保守，但也发生了功能多样化。

除 FPO 外，进行氢循环的产甲烷古菌还编码并优先使用基于氢化酶的系统，通过 F₄₂₀氧化来保存能量。该系统需要两种氢化酶协同作用：胞质中的 FRH 复合物在细胞质中氧化 F₄₂₀并产生 H₂，膜结合的 VHT 复合物则在细胞膜外叶捕获 H₂的电子 。在封闭系统中，FRH 氧化 F₄₂₀并生成 H₂的反应在热力学上是不利的，但 H₂迅速扩散出膜并被 VHT 近乎瞬间氧化（这是一个热力学有利的反应），使得两个反应的净 ΔG < 0，从而得以进行。在某些同时含有这两个模块的产甲烷古菌物种中，已证实存在对 FRH 和 VHT 的偏好，但这种偏好的调节机制和生化基础仍是未解之谜。

产甲烷古菌 ETC 的输出模块

HdrDE 是所有具有 ETC 的产甲烷古菌中普遍保守的输出模块，它介导 MPH₂（或其他膜结合电子载体）的氧化，同时将内源性生成的末端电子受体 HDS 还原。此前，基于 HDS 电对的氧化还原电位为 - 143 mV 的假设，认为 HdrDE 催化的反应接近热力学平衡。但最近的研究表明，HDS 的还原电位更接近其他氧化还原活性硫醇，约为 - 272 mV，这使得在标准条件下，HdrDE 介导的反应在热力学上变得不利。为克服这一能量限制，细胞可能通过保持还原型辅因子的低浓度，来调节 HDS 与 CoM-SH/CoB-SH 的浓度平衡。HdrDE 被认为参与了一个氧化还原循环，以介导 MPH₂的氧化。每转移两个电子至 HdrDE，预计会有两个质子从细胞质中摄取，并释放到假周质空间，同时在细胞质中还原 HDS 时会消耗两个质子。不过，输入模块以及 HdrDE 中 MP 的结合活性位点决定了氧化还原循环的可行性，如果膜外小叶附近的 b 型细胞色素不是 MPH₂氧化的位点，氧化还原循环将无法发挥作用，质子会重新释放回细胞质，这也可能解决反应的不利性问题。因此，对 RNF、FPO 和 HdrDE 与 MP 相关的结构研究，对于验证氧化还原循环假说至关重要。由于 HdrDE 是唯一没有替代模块且在甲烷八叠球菌中必不可少的模块，它可能是 ETC 中的一个关键锚点，围绕它出现了许多进化创新。

厌氧甲烷氧化菌（ANME）中的 ETC

ANME 是一类与含 ETC 的产甲烷古菌关系密切的微生物，它们进行 “反向甲烷生成”，即厌氧甲烷氧化（AOM）。ANME 通常与厌氧细菌（通常是硫酸盐还原菌）形成紧密的代谢伙伴关系，这给获取其纯培养物进行机制研究带来了困难。通过宏基因组组装基因组结合全细胞分析等多种实验表明，ANME 使用与产甲烷古菌相同的一套碳转化酶来实现甲烷生成的完全逆转。不同的是，许多 ANME 在其 ETC 中获得了新的组件，这可能是它们实现碳流逆转的关键适应性变化。

两个不同的 ANME 类群 ANME - 2 和 ANME - 3 与含 ETC 的产甲烷古菌密切相关，它们也编码 RNF、FPO 和 HdrDE。在 ANME 中，MCR 对甲烷的氧化会生成游离的 CoB-SH，后者通过 HdrDE 将电子捐赠给 ETC。AOM 的其他步骤会生成还原型 F₄₂₀和 Fd_red，它们可能分别通过 FPO 和 RNF 进入 ETC。与产甲烷古菌不同，ANME 中的 rnf 操纵子有一个额外的 b 型细胞色素亚基，这可能会改变电子通过复合物的流动，但该亚基的具体作用仍不明确，是未来比较 ANME 和产甲烷古菌中 Rnf 复合物结构组装和生理作用的研究重点。

在所有三个 ANME 进化枝中都未发现氢化酶，这排除了氢循环作为 ANME 能量守恒方式的可能性，也意味着 H₂不能作为 ANME 与其硫酸盐还原菌（SRB）伙伴之间的中间电子载体。此外，一些 ANME 和其他相关生物（如嗜热厌氧乙醇氧化菌）不编码 RNF，可能也不使用 Fd 作为胞质电子载体。ANME 面临的一个独特问题是，需要找到一种机制来氧化 AOM 过程中生成的 MPH₂或其他还原型膜载体，不同的谱系可能已经进化出了不同的解决方案。

ANME 和产甲烷古菌 ETC 最显著的区别在于，ANME 基因组中编码的 MHC 数量丰富（比密切相关的产甲烷古菌多高达七倍）。在产甲烷古菌中，RNF 的 MmcA 亚基是表达量最高的 MHC，而在 ANME 中，通常有多种不同的 MHC，它们具有不同的结构域结构、血红素结合位点范围和在 ETC 中的预测功能。ANME 中 MHC 的分布与谱系有一定关联，ANME - 1 的 MHC 较小，最多约有十个血红素结合位点，而 ANME - 2 和 ANME - 3 的 MHC 较大，部分可达 80 个血红素结合位点。但同一进化枝内 MHC 的具体组成也存在差异，这使得确定适用于所有 ANME 的电子流路径变得困难。

这些 MHC 在电子流中的作用多种多样，首先，MHC 应能够从膜载体池中接受电子，在一些 ANME 中，这可能由类似于地杆菌属的醌醇：细胞色素氧化还原酶的氧化还原酶样复合物来完成，在其他 ANME 中，可能由周质硝酸盐还原酶亚基 NapF 的同源物或脂质锚定的 MHC 来执行这一功能。电子离开膜后，可能沿着较大的 “线状” MHC 传输，这些 MHC 要么整合穿过 S 层并跨越间隙到达细胞外部，要么自聚合成由重复 MHC 亚基组成的 “纳米线” 。一些 ANME - 2 中存在来自地杆菌属的已知纳米线形成 MHC（OmcZ）的同源物，但 ANME 中独特的 MHC 也可能发生聚合。因此，无论特定基因组中编码的 MHC 具体组成如何，其在 ANME 中的作用可能是促进电子从膜中转移出来，并将电子传递给伙伴细菌或其他细胞外受体（如金属）。由于目前仍未获得 ANME/ANME - SRB 的纯培养物或共培养物，未来对这些 MHC 蛋白的研究可能需要通过异源表达研究来推动，这将有助于验证 MHC 参与细胞外电子转移（EET）的能力，并确定这些蛋白在体内和体外的中点电位和化学计量组装。

ANME - 2d 是一个独特的例外，它是 ANME 的一个淡水谱系，其基因组中编码一种硝酸盐还原酶（NAR），使得 AOM 过程中产生的电子能够将硝酸盐（NO₃^-）还原为亚硝酸盐（NO₂^-） 。NAR 作为能量守恒模块的整合，也使得 ANME - 2d 中的膜结合电子载体变为醌醇，这一变化在 ANME - 1 中也有类似假设。但部分物种中的 NAR 面向细胞质膜的外小叶，这使得 NAR 参与氧化还原循环的潜力变得模糊，因此，对 ANME - 2d 中的硝酸盐还原酶和 MHC 的作用仍需进一步研究。

不同产甲烷古菌谱系中的 ETC

近期多项研究通过宏基因组发现或培养出了一些新的产甲烷古菌，它们不属于之前已确立的分类群。这些新产甲烷古菌大多具有 ETC，且呼吸复合物的多样性远超已表征的范围，它们可能促进了与其他代谢（如兼性甲烷生成）相关的生长，但目前尚未观察到这种现象。

在古球菌目和广古菌门中的一些新产甲烷古菌编码异化亚硫酸盐还原酶（DSR），可能参与以亚硫酸盐为电子受体、H₂为电子供体的能量守恒过程。一些甲烷球属物种（如内华达甲烷球）编码一种膜结合的镶嵌氧化还原酶复合物，可能促进电子分叉，使 H₂氧化与 Fd 还原以及膜结合电子载体甲萘醌的还原相偶联。未来对这些新生物能量守恒途径的详细研究，对于揭示甲烷代谢古菌中 ETC 的模块化进化，以及明确影响产甲烷古菌生理学的基因 - 环境相互作用至关重要。

总结与展望

总体而言，ETC 是生物化学创新的重要位点，可能促进了古菌中甲烷生成和厌氧甲烷营养的进化。尽管关于产甲烷古菌和 ANME 能量守恒的（元）基因组假说是丰富的，但由于可处理的模型系统较少，目前缺乏实验生化方法来在体内验证这些生物呼吸复合物和 MHC 的生理功能。一种可行的方法是通过在遗传可操作的产甲烷古菌中异源表达来重构这些模块，将不同的模块整合到已建立的产甲烷古菌 ETC 中，有助于解析细胞功能，揭示新模块出现和相互作用的进化限制。异源表达还可促进结构分析，可能揭示产甲烷古菌和 ANME 之外<