调控脊髓损伤修复新策略：RK33A - 2α 助力神经炎症调控与功能恢复

《Cell Biomaterials》：Mechanism-guided rational design of anti-neuroinflammatory keratin-derived protein for spinal cord injury repair

本文揭示 RK33A - 2α 调控脊髓损伤（SCI）后神经炎症机制，为 SCI 治疗提供新方向。

　　

引言

脊髓损伤（Spinal cord injury，SCI）是一种严重的神经系统疾病，其治疗难度大。SCI 后，物理和生化屏障会限制功能恢复，二次损伤级联反应中的神经元死亡、缺血和炎症等，会限制轴突再生和神经回路重塑，其中神经炎症风暴是 SCI 患者二次损伤的主要发病机制。小胶质细胞在损伤后会迁移到损伤部位，迅速转变为促炎的 M1 表型和发挥抗炎作用、促进组织修复的 M2 表型，但 M2 表型仅短暂浸润。

组织工程结合生物材料已用于 SCI 的再生治疗，但先天免疫细胞对植入物的快速反应限制了治疗效果。因此，开发高效的神经炎症调节剂对 SCI 后的恢复至关重要。

角蛋白是有前景的应用候选材料。在先前研究中，重组角蛋白（Recombinant keratin，RK）33A 对诱导小胶质细胞从 M1 向 M2 表型转变效果显著，植入 RK33A 纳米纤维（RKNF）可减轻炎症、减少胶质瘢痕形成并促进神经再生和运动功能恢复。然而，由于对角蛋白免疫调节机制和结构 - 功能关系缺乏了解，其临床应用研究滞后。

整合素作为细胞粘附跨膜受体，与小胶质细胞极化密切相关。通过与整合素相互作用控制细胞功能，可能是修复受损脊髓的一种方法。在本研究中，科研人员进行了转录组测序分析，验证了角蛋白调节 M2 小胶质细胞极化的内在机制，揭示了整合素与角蛋白之间的相互作用，并研究了角蛋白在小胶质细胞极化中的结构 - 功能关系。

结果

RK33A 调节 BV2 小胶质细胞的 M2 极化

为了解角蛋白调节 M2 小胶质细胞极化的潜在分子机制，科研人员对经脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）和干扰素（Interferon，IFN）-γ 刺激 24 小时、且有无 RK33A 处理的 BV2 细胞进行转录组分析。基因本体论（Gene Ontology，GO）富集分析显示，20 条富集通路中有 4 条与 Jak/Stat 信号通路相关，表明该通路可能在调节小胶质细胞极化中起作用。

进一步生成 Jak 和 Stat 家族基因表达热图，发现 Jak3 和 Stat5 表达下降最明显。基于京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库对差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs）进行功能注释，“ECM - 受体相互作用” 引起了关注。生成整合素家族基因表达热图，发现与 Jak/Stat 相关的整合素 αLβ2（淋巴细胞功能相关抗原 1，Lymphocyte function - associated antigen 1，Lfa - 1）受 RK33A 下调。

通过定量实时聚合酶链反应（Quantitative real - time polymerase chain reaction，real - time qPCR）验证了 Jak/Stat 相关基因的富集，结果与 RNA 测序（RNA - seq）分析一致。

通过蛋白质免疫印迹（western blot）、蛋白质 - 蛋白质相互作用分析（PDBePISA）、免疫共沉淀（co - immunoprecipitation，coIP）和细胞粘附实验等，发现 RK33A 可与 Lfa - 1 相互作用，抑制 Lfa - 1 与细胞间粘附分子 1（Intercellular cell - adhesion molecule 1，Icam - 1）的结合，进而抑制 Jak3/Stat5 信号通路，促进小胶质细胞向 M2 表型极化。

RK33A 的结构分析

RK33A 由中央 α 螺旋杆结构域和两个高度可变的非螺旋结构域（头部和尾部）组成，杆结构域包含 3 个 α 螺旋（1Aα、1Bα 和 2α）和 2 个连接子（L1 和 L12）。科研人员将 RK33A 拆分为 3 个含 α 螺旋的片段进行重组表达，分别命名为 RK33A - 1Aα（1 - 91）、RK33A - 1Bα（92 - 203）和 RK33A - 2α（204 - 404）。

重组蛋白表达和表征

利用大肠杆菌表达系统表达 RK33A 及其片段，并通过镍柱纯化。十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis，SDS - PAGE）显示，RK33A、RK33A - 1Aα、RK33A - 1Bα 和 RK33A - 2α 的分子量分别约为 46、11、14 和 24kDa，且均为单一条带，表明重组蛋白纯化成功。

傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分析检测到了与肽键相关的特征酰胺带。细胞计数试剂盒 - 8（Cell counting kit - 8，CCK - 8）实验表明，各片段均具有良好的细胞相容性。圆二色谱（Circular dichroism，CD）分析显示，所有蛋白溶液均显示出特征性的 α 螺旋光谱，且无浓度依赖性。

2α 螺旋片段调节小胶质细胞极化

通过免疫荧光染色和流式细胞术检测发现，RK33A、RK33A - 1Aα、RK33A - 1Bα 和 RK33A - 2α 均可减少 CD86⁺细胞数量，增加 CD206⁺细胞数量，其中 RK33A - 2α 的作用更显著。

进一步研究发现，RK33A 片段、Jak3/Stat5 抑制剂（BD750）和 Lfa - 1 抑制剂（SAR1118）处理后，Lfa - 1/Jak3/Stat5 信号通路相关蛋白表达均显著降低，RK33A - 2α 组抑制作用最明显。

通过计算模拟、coIP 分析和细胞粘附实验，证实 RK33A - 2α 与 Lfa - 1 的 Itgb2 相互作用更强，能更有效地抑制 Jak3/Stat5 信号通路，调节 M2 小胶质细胞极化。

RKNFs 的制备和表征

为评估 RK33A - 2α 在体内的作用，通过静电纺丝法制备了聚己内酯（Polycaprolactone，PCL）纳米纤维、RKNF33A 和 RKNF33A - 2α。扫描电子显微镜（Scanning electron microscopy，SEM）观察显示，所有纳米纤维均呈排列分布，且直径在 100 - 400nm 范围内。

水接触角测定表明，RKNF33A 和 RKNF33A - 2α 的亲水性优于 PCL 纳米纤维。荧光标记实验显示，角蛋白在纳米纤维中均匀分布。FTIR 分析证实了 RK 与 PCL 的成功融合，且 RKNFs 在 14 天内的降解率约为 25% - 30%，满足体内实验要求，同时其化学结构在孵育 2 周后仍保持稳定。

2α 螺旋片段促进 SCI 后功能恢复

建立大鼠 T9 脊髓半切模型，分别植入无纳米纤维（SCI 组）、PCL 纳米纤维（PCL 组）、RKNF33A（RKNF33A 组）或 RKNF33A - 2α（RKNF33A - 2α 组）。通过 Basso - Beattie - Bresnahan（BBB）评分和单侧半切（Unilateral hemisection，UHS）评分评估发现，RKNF33A - 2α 组在 2、4 和 8 周时后肢运动功能恢复明显优于其他组。

足迹分析显示，RKNF33A - 2α 组在 4 和 8 周时右脚印更清晰，步长更长。苏木精 - 伊红（Hematoxylin - eosin，H&E）染色评估纳米纤维的全身毒性，结果显示 4 组主要器官均无明显损伤和组织病理学差异。

2α 螺旋片段促进 SCI 后神经再生和减少胶质瘢痕

在 1 和 8 周时处死大鼠，观察发现 RKNF33A - 2α 组损伤部位的可见空腔更小。H&E 和 Luxol fast blue（LFB）染色显示，该组损伤脊髓组织生长增加，髓鞘保留增多。

免疫荧光染色显示，RKNF33A - 2α 组在 8 周时胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，Gfap）表达降低，神经丝蛋白 200（Neurofilament 200，NF200）和 β - 微管蛋白 III 表达增加，表明其能减少胶质瘢痕形成，促进神经再生，同时该组 Itgb2⁺细胞数量减少，与细胞实验结果一致。

2α 螺旋片段促进 SCI 后小胶质细胞的 M2 极化

通过免疫荧光染色检测 CD86 和 CD206 发现，RKNF33A - 2α 组在 1 和 8 周时 CD86⁺/Iba1⁺细胞低于其他组，CD206⁺/Iba1⁺细胞多于其他组，表明其促进 M2 极化的效果优于 RK33A。

讨论

角蛋白在促进小胶质细胞从 M1 向 M2 表型转变、减轻 SCI 后神经炎症方面具有重要价值，但作用机制尚未完全明确。Lfa - 1 是整合素家族成员，与 Icam - 1 的相互作用在炎症发病机制中起关键作用，阻断 Lfa - 1 与其配体的相互作用是潜在的免疫抑制靶点。本研究表明，RK33A 主要与 Lfa - 1 的 Itgb2 相互作用，抑制 Lfa - 1 与 Icam - 1 的结合，进而抑制神经炎症。

Jak/Stat 信号通路是调节小胶质细胞极化的关键因素，激活该通路会诱导 M1 小胶质细胞极化。本研究中，RK33A 竞争性结合 Lfa - 1，抑制 BV2 小胶质细胞中 Jak3/Stat5 的激活，可能是其调节小胶质细胞极化的机制。此外，PI3K/AKT/mTOR 信号通路与 Jak/Stat 信号通路存在一些重叠基因，二者可能存在串扰，这值得进一步研究。

研究发现，RK33A - 2α 在促进小胶质细胞从 M1 向 M2 表型转变方面效果优于其他片段，其能与 Lfa - 1 的 Itgb2 相互作用，抑制 Jak3/Stat5 信号通路，在大鼠 T9 半切 SCI 模型中效果更佳。这可能与 RK33A - 2α 中谷氨酸（GLU）与 Itgb2 的氨基酸位点相互作用形成更多氢键和盐键，以及其较长的序列和全面的 α 螺旋氨基酸结构有关。

尽管 RK33A - 2α 在 SCI 修复中表现出良好的效果，但 SCI 治疗面临诸多挑战，如脊髓再生能力差、结构复杂、炎症持续等。因此，开发联合治疗策略，如结合生物组织工程、神经营养因子加载和干细胞移植等，可能会取得更好的治疗效果，RK33A - 2α 可作为基础支架构建材料。

结论

角蛋白是调节 M2 小胶质细胞表型的有效生物材料。本研究揭示了 RK33A 的内在免疫调节机制，即通过竞争性抑制 Lfa - 1 与 Icam - 1 的结合，抑制 Jak3/Stat5 信号通路。研究还发现，在 RK33A 的 α 螺旋片段中，RK33A - 2α 抗炎效果最强，其纳米纤维可增强 M2 小胶质细胞极化，促进大鼠 T9 半切 SCI 模型的组织病理学恢复和功能改善。这些发现验证了基于内在机制和结构 - 功能关系设计高效抗炎剂的可行性，为开发先进的生物材料和 SCI 治疗方法提供了理论基础。

方法

实验主要涉及细胞培养和处理、RNA - seq 分析、real - time qPCR、western blot 分析、免疫荧光染色、流式细胞术、蛋白质 - 蛋白质相互作用分析、coIP、细胞粘附实验、RK 蛋白克隆、RK 表达和纯化、RK 表征、RKNFs 制备、RKNFs 表征、体外稳定性测定、动物实验、BBB 和 UHS 评分、足迹分析、石蜡组织切片制备、H&E 和 LFB 染色以及统计分析等方法。通过这些方法，对 RK33A 及其片段在调节小胶质细胞极化、促进神经再生和改善脊髓损伤后功能恢复等方面的作用进行了全面研究。