全面解析古菌 RNA 修饰：23S rRNA 保守 P 环上 m7G 修饰的重大发现及其意义

《Cell Reports》：Comprehensive nucleoside analysis of archaeal RNA modification profiles reveals an m7G in the conserved P loop of 23S rRNA

这篇研究通过液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）技术全面分析了古菌 RNA 修饰。发现多种修饰，包括新的 mRNA 修饰和温度响应性修饰，还鉴定出 23S rRNA P 环上的 m7G 修饰及其相关酶。为理解古菌适应极端环境机制和 RNA 修饰功能提供新视角。

　　### 研究背景
许多古菌生活在极端环境中，RNA 化学修饰对其在高温环境下维持 RNA 稳定性和功能至关重要。目前已发现超 170 种 RNA 修饰，这些修饰具有化学和功能多样性，但古菌中修饰核苷及其功能的研究尚不完整，且 mRNA 修饰分析存在诸多挑战。在检测 RNA 修饰的方法中，下一代测序（NGS）和质谱（MS）是主要手段。NGS 虽有优势，但存在预处理导致的问题，如不完全转化、RNA 降解和难以同时检测多种修饰等。纳米孔直接 RNA 测序（RNA-seq）在区分修饰和未修饰核苷的电信号时面临挑战。而液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）能直接检测 RNA 修饰，无需 cDNA 扩增或核苷转化，还可结合寡核苷酸 LC-MS/MS 分析保留部分序列信息。

研究结果

1. 古菌和非古菌物种的全局核苷分析：利用超高效液相色谱结合三重四极杆质谱（UHPLC-QqQ MS）分析五个古菌物种的总 RNA，鉴定出 22 - 32 种修饰核苷，不同物种有独特的修饰模式。其中 16 种修饰核苷在所有测试古菌物种中都存在，部分修饰仅在嗜热菌或特定属的古菌中出现。通过层次聚类分析发现，同一属的物种核苷谱最相似，且 RNA 修饰谱能反映物种间的关系，支持古菌在化学分类上与细菌和真核生物不同的观点。
2. mRNA 富集组分中 RNA 修饰的核苷分析：为检测 mRNA 中的修饰核苷，采用严格流程去除大部分非编码 RNA（ncRNA）。经 rRNA 耗尽和尺寸排阻自旋柱处理后，mRNA 富集样品中超过 98% 的 reads 映射到蛋白质编码基因。定性筛选和定量分析后，在古菌 mRNA 中鉴定出 6 种修饰：m¹A、m¹I、ac⁴C、m⁵C、Cm 和 Gm。其中 m¹I 是首次在 mRNA 中被鉴定出，古菌 mRNA 修饰与真核生物有重叠，但与细菌明显不同。
3. 鉴定嗜热古菌（T. kodakarensis）中温度敏感的修饰：以嗜热古菌T. kodakarensis为研究对象，在不同温度下培养并提取总 RNA 进行分析。结果显示，超过三分之一的修饰核苷在生长温度偏离最适温度 85°C 时，相对丰度发生显著变化。如 ac⁴C 和 ac⁴Cm 随温度升高而增加，m⁵U 则随温度升高而减少。进一步分析不同 RNA 亚组分发现，不同修饰在大 RNA、小 RNA 和 mRNA 富集组分中的变化存在差异，且 m⁵U 在小 RNA 中的变化可能与 m⁵s²U 的合成有关。
4. 预测古菌 RNA 修饰酶：通过基于序列同源性的 HMMER hmmscan 搜索和与已知 RNA 修饰酶的结构比较，预测古菌 RNA 修饰酶。将修饰与预测酶的关联分为两组，约 60% 的修饰属于组 I，与预测的单甲基化或乙酰化相关；组 II 包含 15 种修饰，其相关酶难以通过结构比较预测。利用 Foldseek 搜索结构相似性，为组 II 修饰鉴定出更多潜在的酶候选物。
5. 鉴定T. kodakarensis中 TK0008 为鸟嘌呤 - N7 - 甲基转移酶：研究发现 m⁷G 主要位于T. kodakarensis的 23S rRNA 中，通过对 rRNA 进行选择性耗尽和富集实验，确定了 m⁷G 在 23S rRNA 中的位置。经生物信息学分析和实验验证，发现 TK0008 基因编码的蛋白可能是负责 23S rRNA 中 m⁷G 修饰的甲基转移酶。敲除 TK0008 基因后，m⁷G 修饰水平显著降低，体外实验也证实了 rTK0008 蛋白具有甲基转移酶活性，且确定了 m⁷G 在 23S rRNA 中的主要甲基化位点为 2354 位。
6. 鉴定 23S rRNA 保守 P 环中的 m⁷G 修饰：通过对T. kodakarensis 70S 核糖体的冷冻电镜（cryo-EM）结构分析、探针杂交和核酸酶处理实验，确定 m⁷G 修饰位于 23S rRNA 的 P 环（peptidyl transferase center，PTC）中 2354 位。该位置在翻译过程中与 tRNA 的相互作用可能具有重要意义，且在大肠杆菌和人类核糖体的相应位置未发现类似修饰。

研究讨论

本研究建立了不同古菌属的综合核苷谱，揭示了温度敏感修饰和新的 mRNA 修饰。古菌 mRNA 中未发现 m⁶A 修饰，与真核生物和细菌不同，这可能与古菌在极端环境中生存所采用的 RNA 修饰酶差异有关。2′ - O - 甲基化在古菌 rRNA、tRNA 和 mRNA 中都很丰富，可能有助于提高 RNA 的水解稳定性。结合 MS 分析和数据库挖掘预测 RNA 修饰酶的方法是有效的，但仍面临一些挑战，如难以预测与其他域无明显同源性的古菌酶。本研究首次报道了古菌核糖体 RNA 中的 m⁷G 修饰及其相关基因，拓展了对 m⁷G 修饰的认识。同时，研究还发现古菌 mRNA 修饰与 tRNA 修饰可能存在共同的生物合成机制，这引发了关于 mRNA 修饰调控机制的思考。

研究局限性

本研究仅涵盖可通过核苷标准验证的 RNA 修饰，未覆盖全部 RNA 修饰。研究中预测的 RNA 修饰酶主要基于 Modomics 数据库中的已知酶，虽发现了 TK0008 作为鸟嘌呤 - N7 - 甲基转移酶，但仍需对每个新预测的酶活性进行验证。此外，23S rRNA 中 G2354 位的N7 - 甲基化可能不是古菌转录组中唯一的 m⁷G 位点，结合其他直接 RNA 测序技术可能有助于发现更多潜在修饰位点。

资源可用性

本研究的相关资源和试剂可向通讯作者 Ivan R. Corrêa Jr.（[e-mail]）获取。研究中的原始 RNA 测序数据、寡核苷酸分析数据和核苷分析数据已分别存储在相应数据库中，可公开获取。