打破基因编辑困境：内生 CRISPR-Cas 系统解锁多杀菌素产生菌遗传改造新篇

《Science China Life Sciences》：Developing a robust genome editing tool based on an endogenous type I-B CRISPR-Cas system in Saccharopolyspora spinosa

为解决多杀菌素链霉菌（Saccharopolyspora spinosa）遗传改造难题，研究人员开展相关研究，构建高效编辑工具，意义重大。

　　多杀菌素链霉菌（Saccharopolyspora spinosa）是一种能产生重要环保生物杀虫剂多杀菌素（spinosyns）的工业稀有放线菌。然而，由于其遗传操作困难和缺乏有效的基因组工程工具，对它的开发利用受到限制。在这项研究中，研究人员基于生物信息学分析，结合多杀菌素链霉菌中的质粒干扰试验，对其内源 I-B 型 CRISPR-Cas 系统的活性及其识别的前间隔序列邻近基序（PAMs）进行了表征。通过导入含有设计好的 miniCRISPR 阵列（重复序列 + 自靶向间隔序列 + 重复序列）和修复模板的编辑质粒，研究人员实现了基因敲除 100% 的编辑效率。利用这一工具，研究人员系统地消除了由限制修饰（RM）系统构成的遗传屏障。研究表明，同时消除一个 I 型 RM 系统（由 A8926_1903/1904/1905 编码）和两个 II 型 RM 系统（由 A8926_1725/1726 和 A8926_2652/2653 编码）后，复制型和整合型质粒（pSP01 和 pSI01）的转化效率分别提高了约 3.9 倍和 4.2 倍。以同时敲除这三个 RM 基因的工程菌株为起始菌株，研究人员实现了 75-kb 多杀菌素生物合成基因簇（BGC）的高效删除和基因插入。总之，研究人员开发了一种基于多杀菌素链霉菌内源 I 型 CRISPR-Cas 系统，并结合 RM 系统消除的可靠且高效的基因组编辑工具。这是首次在非模式工业放线菌中建立基于内源 CRISPR-Cas 的基因组编辑工具。