成年海马神经干细胞维持与血管邻近的关键：VEGF 的细胞内信号机制

《Molecular Neurobiology》：Intracrine VEGF Signaling Is Required for Adult Hippocampal Neural Stem Cell Maintenance and Vascular Proximity

为解决 VEGF 对成年海马神经干细胞（NSCs）调控机制的争议，研究人员探究 VEGF 信号机制，发现其依赖细胞内 VEGFR2 激活，为相关研究提供新思路。

　　

论文解读：成年海马神经干细胞维持与血管邻近的关键机制探索

在大脑的 “记忆中心”—— 海马体中，齿状回（DG）区域藏着神经干细胞（NSCs），它们如同大脑的 “种子”，不断产生新神经元，对海马的记忆和情绪调节功能至关重要。一直以来，血管内皮生长因子（VEGF）被认为在成年海马神经发生中扮演重要角色，过往研究发现，它能促进 NSCs 增殖，还和 NSCs 与血管的邻近关系有关。可关于 VEGF 如何调控 NSCs，科学界却存在诸多矛盾观点。一方面，有研究显示 NSCs 依赖自身合成的 VEGF，敲低 VEGF 会导致 NSCs 池枯竭；但另一方面，也有研究指出，中和 DG 中的 VEGF 对基础细胞增殖和神经发生并无影响，VEGF 促进神经发生可能是通过间接机制实现。这种不确定性，让研究人员对 VEGF 在 NSCs 调控中的真实作用摸不着头脑。

为了揭开这一谜团，来自美国俄亥俄州立大学等机构的研究人员开展了一系列研究，相关成果发表在《Molecular Neurobiology》上。

研究人员采用了多种关键技术方法。在细胞层面，他们分离培养成年小鼠 DG 的 NSCs，通过免疫荧光染色、免疫印迹等技术检测相关蛋白表达和信号通路变化；在动物实验方面，利用转基因小鼠和病毒载体技术，对小鼠进行立体定位手术，将病毒注入 DG 区域，研究 VEGF 信号缺失对 NSCs 的影响；此外，还运用 RNAscope 原位杂交技术，在转录水平分析 VEGF 和 VEGFR2 的共表达情况。

研究结果如下：

• VEGF 和 VEGFR2 在单个 RGL-NSCs 中共表达：通过 RNAscope 原位杂交和免疫标记技术，研究人员发现几乎所有（92.5%）的 RGL-NSCs 都同时表达 Vegfa 和 Kdr（VEGFR2 的编码基因）。在 VEGF-GFP 转录报告小鼠中，也观察到 Nestin⁺ RGL-NSCs 中 VEGFR2 和 VEGF-GFP 共表达。在培养的 NSCs 中，免疫标记显示 VEGF 和 VEGFR2 在细胞内质网（ER）、高尔基体以及细胞质中均有分布，为它们在细胞内相互作用提供了可能。
• 培养的 DG NSCs 依赖细胞内 VEGF 进行磷酸化信号传导：实验表明，用细胞渗透性 VEGFR2 抑制剂 SU5416 或 SU1498 处理培养的 NSCs，会显著抑制 Akt 磷酸化，而 VEGF 中和抗体（nAb）结合细胞外 VEGF 却不影响 pAkt 水平，添加外源性重组小鼠 VEGF 也无法改变 Akt 磷酸化。在对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的实验中，证实了这些试剂的生物活性。这一系列结果表明，NSC 衍生的 VEGF 通过细胞内 VEGFR2 进行信号传导。
• DG RGL-NSCs 在体内外均缺乏细胞表面 VEGFR2：免疫细胞化学染色显示，非透化的培养 NSCs 表面没有 VEGFR2 免疫反应，而培养的小鼠脑内皮细胞（bEnd.3）表面和细胞内均有 VEGFR2 免疫反应。对急性分离的 RGL-NSCs 进行流式细胞术分析，发现内皮细胞表面可检测到 VEGFR2，而 NSCs 表面几乎检测不到，这表明 RGL-NSCs 表达 VEGF 和 VEGFR2，但 VEGFR2 不在细胞表面定位。
• NSCs 表达的脱落酶可切割 VEGFR2：分析先前的单细胞 RNA 测序和液相色谱串联质谱数据，发现 NSCs 表达多种脱落酶，如 Mmp15、Adam9、Adam10 和 Adam12 等。用肿瘤坏死因子 -α 蛋白酶抑制剂 1（TAPI-1）处理培养的 NSCs，可增加细胞表面 VEGFR2 免疫反应，并恢复 NSCs 对细胞外 VEGF 的 pAkt 反应，说明脱落酶切割 VEGFR2 抑制了 NSC 对细胞外 VEGF 的反应。
• 培养的 NSCs 依赖细胞自主 VEGF 维持运动性和防止耗竭：在划痕实验中，感染 Vegfa shRNA 的培养 NSCs 迁移能力受损，而对照 shRNA 处理的细胞不受影响，表明 VEGF 缺失以细胞自主方式影响 NSC 迁移。在邻居救援实验中，敲低 VEGF 导致 Vegfa^lox/lox NSCs 早期过度增殖，长期自我更新能力丧失，而野生型 NSCs 不受影响，说明细胞自主 VEGF 信号对防止 NSC 激活和耗竭至关重要。
• 体内 RGL-NSCs 依赖细胞自主 VEGF 维持静止状态和与血管的邻近关系：在成年小鼠 DG 中，用表达 Vegfa shRNA 的病毒处理后，GFP⁺ RGL-NSCs 和中间祖细胞（IPCs）与血管的距离增加，而 GFP^-细胞不受影响，且 GFP⁺ NSPCs 向 IPCs 表型转变，说明自我合成的细胞自主 VEGF 对维持 NSPC 与血管的邻近关系和防止 RGL-NSC 过度分化至关重要。

研究结论表明，VEGF 通过细胞内 VEGFR2 信号传导，对维持 RGL-NSC 静止状态、支持 NSPC 与血管邻近关系意义重大。这一发现解释了为何 RGL-NSCs 依赖自身 VEGF，也为成年神经发生相关研究提供了新视角。它意味着补充外源性 VEGF 可能无法有效作用于 RGL-NSCs，为相关治疗策略的设计提供了参考。不过，研究也存在一些局限性，如 VEGF 和 VEGFR2 共表达及亚细胞定位的研究不够深入，未充分探讨其他受体和共受体的作用，下游信号通路也有待进一步明确等。未来研究可针对这些问题展开，有望更深入地揭示成年海马神经干细胞维持和神经发生的调控机制，为神经系统疾病的治疗带来新的突破。