CRISPR/Cas9 技术靶向 UMSBP 基因，为利什曼原虫研究及疫苗开发点亮新光

为探究 CRISPR/Cas9 技术编辑利什曼原虫（Leishmania major）UMSBP 基因效果，研究人员开展研究，发现其突变株有潜力，意义重大。

　　研究人员在利什曼原虫（Leishmania major）中运用 CRISPR/Cas9 技术，评估其对与动基体 DNA（kDNA）相关基因 —— 通用微环序列结合蛋白（universal minicircle sequence binding protein，UMSBP）的编辑效率，UMSBP 参与线粒体呼吸和动基体分裂。借助该工具包，研究人员构建出 UMSBP 标记 mNG（UMSBP mNG-tagged）的利什曼原虫和 UMSBP 单敲除（LmUMSBP^+/?）的寄生虫，经 PCR、共聚焦显微镜和蛋白质免疫印迹（Western blot）分析予以证实。在体外分析了前鞭毛体在培养物中的生长速率及其对巨噬细胞的感染性。用LmUMSBP^+/?突变株免疫小鼠，在受到野生型（wild type，WT）利什曼原虫攻击后测量病变大小和寄生虫负荷。对淋巴结细胞培养上清液中的细胞因子进行定量。结果显示，UMSBP mNG 标记蛋白在前鞭毛体和胞内无鞭毛体的动基体内均成功表达和定位，证实了荧光标记在利什曼原虫生命周期各阶段的一致性。与野生型利什曼原虫相比，减毒的LmUMSBP^+/?寄生虫在培养物中的生长显著减缓（P＜0.05），细胞凋亡增加（P＜0.05），并且硫氧还蛋白过氧化物酶（tryparedoxin peroxidase，TXNPx）和锥虫硫醇合成酶（trypanothione synthetase，TryS）基因表达下调。LmUMSBP^+/?突变株在易感的 BALB/c 小鼠模型中不会引发病变。此外，用LmUMSBP^+/?寄生虫免疫可诱导 Th1 免疫反应，其特征为细胞培养中干扰素 -γ（IFN-γ）显著升高、白细胞介素 - 4（IL-4）显著降低（P＜0.001），这与对野生型利什曼原虫攻击的部分保护作用相关，BALB/c 小鼠体内寄生虫负荷和病变发展减少就是证明。在本研究中，研究人员成功验证了在利什曼原虫中实用的 CRISPR/Cas9 工具包，其靶向动基体相关基因 UMSBP。研究结果表明，UMSBP 单等位基因敲除突变体有望成为研究动基体在利什曼原虫生物学中作用的宝贵工具，也可能作为抗利什曼原虫感染的减毒活疫苗的潜在候选对象。