异荭草素通过降低 KDM4A 水平抑制巨噬细胞焦亡和动脉粥样硬化的发生

《Inflammation》：Isoorientin Ameliorates Macrophage Pyroptosis and Atherogenesis by Reducing KDM4A Levels and Promoting SKP1-Cullin1-F-box E3 Ligase-mediated NLRP3 Ubiquitination

动脉粥样硬化（AS）严重威胁健康，现有降脂疗法效果有限。研究人员开展异荭草素（ISO）对 AS 进程中巨噬细胞焦亡影响的研究。结果显示，ISO 可减轻 AS 病变和巨噬细胞焦亡，机制与降低赖氨酸去甲基化酶 4A（KDM4A）水平有关。该研究为 AS 治疗提供新方向。

　　在人体的血管系统中，动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）就像一颗 “定时炸弹”，时刻威胁着人们的健康。它是一种慢性炎症性疾病，会使脂肪斑块在血管内壁不断堆积，阻碍血液流动，进而引发心脏、大脑等重要器官的缺血性疾病，成为全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一。尽管目前有一些降脂治疗手段，但 AS 仍然难以被有效控制，寻找新的治疗方法迫在眉睫。

中南大学湘雅药学院等研究机构的研究人员开展了一项关于异荭草素（Isoorientin，ISO）对 AS 进程中巨噬细胞焦亡影响的研究，相关成果发表在《Inflammation》杂志上。研究发现，ISO 能够显著减轻 AS 病变、抑制脂质积累和巨噬细胞焦亡，为 AS 的治疗提供了新的潜在策略。

研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。在动物实验方面，以 8 周龄野生型雄性 C57BL/6 和 ApoE^-/-小鼠为实验对象建立 AS 小鼠模型 。在细胞实验层面，从 C57BL/6 小鼠获取骨髓细胞并诱导分化为骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）。同时，运用免疫荧光染色、蛋白质免疫印迹（WB）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、染色质免疫沉淀 - 定量聚合酶链反应（ChIP-qPCR）和免疫共沉淀（co-IP）等技术，从分子和细胞水平深入探究相关机制。

研究结果主要如下：

1. ISO 抑制巨噬细胞焦亡并减轻 ApoE^-/-小鼠的动脉粥样硬化：给 ApoE^-/-小鼠喂食高脂饮食建立 AS 模型后，经 ISO 处理，通过油红 O 染色、苏木精 - 伊红（HE）染色等检测发现，ISO 显著减少了小鼠主动脉病变面积、脂质沉积和坏死核心区域，同时降低了促焦亡细胞因子 IL-18 和 IL-1β 的血清水平，表明 ISO 在减轻 AS 发展和抑制巨噬细胞焦亡中发挥关键作用。
2. ISO 在体外减少 ox-LDL 诱导的 BMDM 焦亡：在体外实验中，用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导 BMDM 焦亡，再给予 ISO 处理。通过 CCK-8、Hoechst/PI 染色、LDH 释放检测和 WB 分析等方法发现，ISO 能剂量依赖性地逆转 ox-LDL 诱导的细胞活力下降，减少焦亡细胞比例，降低 N-GSDMD 和 cleaved caspase 1 蛋白水平，减少 IL-18 和 IL-1β 分泌，说明 ISO 可有效减轻 ox-LDL 诱导的 BMDM 焦亡。
3. ISO 通过降低 KDM4A 水平减轻巨噬细胞焦亡：借助生物信息学分析预测 ISO 的潜在靶点，发现 KDM4A 可能是关键靶点。实验表明，在 AS 模型小鼠和 ox-LDL 处理的巨噬细胞中，KDM4A 表达上调，而 ISO 处理后其表达降低。在 BMDMs 中过表达 KDM4A 会削弱 ISO 的保护作用，促进巨噬细胞焦亡，说明 ISO 减轻巨噬细胞焦亡的机制与降低 KDM4A 水平有关。
4. KDM4A 过表达抵消 ISO 对 ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化的缓解作用：在 ApoE^-/-小鼠中，利用 AAV-F4/80-oeKDM4A 载体使巨噬细胞特异性过表达 KDM4A，再给予 ISO 处理。经检测发现，KDM4A 过表达加剧了动脉病变、脂质积累和坏死核心区域扩大，增加了巨噬细胞焦亡相关指标，抵消了 ISO 对 AS 的缓解作用。
5. KDM4A 通过 H3K36me3 去甲基化抑制 SKP1 转录：通过生物信息学分析和实验验证，发现 KDM4A 的下游靶点是 SKP1。在小鼠体内，巨噬细胞特异性过表达 KDM4A 会导致主动脉根部 SKP1 表达降低。ChIP-qPCR 实验表明，KDM4A 过表达增加了其与 SKP1 启动子的结合，减少了 H3K36me3 和 H3K9me3 在 SKP1 启动子附近的富集，尤其是 H3K36me3，说明 KDM4A 主要通过对 H3K36me3 去甲基化来抑制 SKP1 转录。
6. SKP1 通过泛素化减少 NLRP3 炎症小体的组装和激活：研究发现，SKP1 与 NLRP3 存在结合关系，且 SKP1 过表达可促进 NLRP3 的泛素化，抑制 NLRP3 与 ASC 的结合，减少炎症小体的形成。在过表达 KDM4A 的 BMDMs 中过表达 SKP1，可降低 ASC 的阳性染色，进一步证明 SKP1 能减少炎症小体的组装和激活。
7. SKP1 过表达恢复 ISO 对 BMDM 焦亡的抑制作用：在同时过表达 KDM4A 和 SKP1 的 BMDMs 中，经检测发现，SKP1 过表达降低了 PI 阳性染色率，恢复了细胞活力，减少了 LDH 释放，降低了 N-GSDMD 和 cleaved caspase 1 水平，减少了 IL-18 和 IL-1β 分泌，表明 SKP1 过表达可恢复 ISO 对 BMDM 焦亡的抑制作用。
8. SKP1 恢复可挽救 ISO 对 ApoE^-/-小鼠 AS 的改善作用：在 ApoE^-/-小鼠中，同时过表达 KDM4A 和 SKP1 后给予 ISO 处理。结果显示，SKP1 过表达显著减少了主动脉病变、减轻了脂质积累和坏死核心区域，降低了巨噬细胞焦亡相关指标，减少了 IL-18 和 IL-1β 血清水平，说明 SKP1 恢复可挽救 ISO 对 ApoE^-/-小鼠 AS 的改善作用。

综合研究结论和讨论部分，该研究揭示了 ISO 通过抑制 KDM4A 表达，激活 SKP1 转录，进而阻断 NLRP3 炎症小体的组装和激活，发挥抗动脉粥样硬化作用的机制。这为理解 AS 的发病机制提供了新视角，也为开发治疗 AS 的新型药物提供了潜在靶点和理论依据。不过，目前该研究缺乏临床数据，未来还需进一步开展相关研究，推动其临床应用。