一种一锅法联合 RT-RPA 扩增与 CRISPR/Cas12a 检测技术：登革热病毒检测新突破

《BMC Microbiology》：A one-pot method for universal Dengue virus detection by combining RT-RPA amplification and CRISPR/Cas12a assay

为解决传统登革病毒（DENV）检测方法的局限，研究人员开发一锅法检测体系，该体系灵敏特异，为病毒检测提供新途径。

　　登革病毒（DENV）是一种通过蚊子传播的病毒，在热带和亚热带地区广泛流行。它就像一个隐藏在暗处的 “健康杀手”，全球每年有超过 390 万人感染，约 2.5 万人因此失去生命。DENV 有 4 种血清型，分别是 DENV-1、DENV-2、DENV-3 和 DENV-4，每种血清型还包含多种基因型，这使得它的 “身份” 复杂多变。感染 DENV 后，患者的症状轻重不一，从轻微的登革热到严重的登革出血热和登革休克综合征，严重威胁着人们的生命健康。

目前，还没有针对 DENV 的有效疫苗和特效治疗药物，因此早期检测就显得尤为重要。然而，传统的检测方法，如病毒分离、血清学检测、酶联免疫吸附试验、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和实时定量 RT-PCR（qRT-PCR）等，存在着诸多不足。这些方法要么依赖特定的 DENV 抗体、昂贵的设备，要么需要专业技术人员操作，在资源有限的地区难以推广使用。

为了解决这些问题，海军军医大学的研究人员开展了一项关于登革病毒检测的研究。他们将重组酶聚合酶扩增（RPA）技术与成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及相关蛋白 12a（CRISPR/Cas12a）系统相结合，开发出了一种新型的一锅法通用 DENV 检测系统，并建立了相应的基于 RT-RPA-CRISPR/Cas12a 的侧向流动试纸条（LFD）检测平台。

在这项研究中，研究人员用到的主要关键技术方法包括：基于 DENV 基因组保守区域设计特异性引物和 Cas12a crRNA；利用商业化试剂盒进行 RT-RPA 反应和 CRISPR/Cas12a 检测反应；通过核酸提取、质粒稀释等操作进行灵敏度和特异性分析；使用侧向流动试纸条进行可视化检测 。

研究结果如下：

• 工作流程与体系构建：建立了一锅法 RPA CRISPR/Cas12a 检测 DENV 的工作流程。先从感染样本中提取核酸作为模板，用基于 DENV 四种血清型保守区域设计的通用引物进行 RT-RPA 扩增，再将 CRISPR/Cas12a 检测反应体系通过离心与扩增产物混合，利用 FAM 标记的单链 DNA 报告分子进行检测，整个过程 40 分钟内完成，并成功建立了 LFD 平台。
• 引物和 crRNA 筛选：设计合成 2 条正向和 7 条反向 RPA 引物，经筛选，F1/R1 引物对扩增效果最佳；设计 4 种 crRNA，评估后 crRNA2 性能最优。
• 反应条件优化：对 Cas12a 和 crRNA 浓度进行优化，发现 500 nM Cas12a 和 1000 nM crRNA 时检测反应荧光强度最高；确定 38℃为最佳反应温度。
• 灵敏度和特异性分析：该检测系统的检测限（LOD）为 91.7 copies/test；对 26 个病毒感染细胞样本检测，能准确识别所有 DENV 阳性样本，与其他 4 种干扰病毒无交叉反应，特异性达 100%。
• 检测系统验证：用合成的包含 DENV-1 至 DENV-4 核酸序列的重组质粒进行检测，证明该平台可成功识别 4 种 DENV 血清型；LFD 平台也能准确识别 4 种 DENV 血清型，确定 25 nM 为 ssDNA 报告分子的合适浓度，其检测灵敏度约为 250 copies/test。

研究结论和讨论部分指出，该一锅法 RT-RPA-CRISPR/Cas12a 检测系统对 DENV 检测具有高特异性和灵敏度，且无假阳性结果。相比传统方法，它无需复杂设备，检测时间短，能降低交叉污染风险，减少误诊。该系统不仅能检测所有 4 种 DENV 血清型，在临床登革热检测中具有应用潜力，而且 LFD 平台成本低、操作方便，在资源有限地区有很大的应用前景，为即时检验（POCT）和体外诊断（IVD）产品开发提供了支持 。不过，CRISPR/Cas12a 系统的脱靶效应不能忽视，后续还需进一步研究优化。总的来说，这项研究为 DENV 检测提供了新方法，也为其他人类病毒检测方法的开发提供了思路，相关研究成果发表在《BMC Microbiology》上。