肝癌治疗新希望 —— 调控 miR-590-5p/TIMP3 轴抑制肿瘤发展

《Molecular Cancer》：Circular RNA circDCUN1D4 suppresses hepatocellular carcinoma development via targeting the miR-590-5p/ TIMP3 axis

为探究 circDCUN1D4 在肝癌（HCC）中的作用，研究人员开展相关研究，发现其可抑制 HCC 进展，为肝癌治疗提供新方向。

　　

肝癌，作为全球范围内严重威胁人类健康的重大疾病，一直是医学研究领域的重点攻克对象。近年来，虽然在肝癌的诊断和治疗方面取得了一定进展，但现有的治疗手段仍存在诸多局限性，患者的总体预后并不理想。在这样的背景下，寻找新的治疗靶点和策略成为了肝癌研究的关键所在。

环状 RNA（circRNA）作为一类特殊的非编码 RNA，近年来在肿瘤研究领域备受关注。它们具有独特的闭环结构，在多种细胞过程中发挥着重要的调控作用，其表达异常与多种癌症的发生、发展密切相关。然而，在肝癌研究中，尽管已经发现了一些 circRNA 与肝癌的关联，但对于许多 circRNA 的具体功能和作用机制仍知之甚少。circDCUN1D4 便是其中之一，虽然初步研究显示它在结直肠癌和肺腺癌中具有抑制转移的作用，且在肝癌组织中表达下调，可能与患者生存改善相关，但它在肝癌中的精确靶点、调控通路及下游效应器尚未明确。

为了深入探究 circDCUN1D4 在肝癌发展中的作用及潜在机制，北京工业大学、Allife 医学科技有限公司等机构的研究人员开展了一系列研究。最终研究发现，circDCUN1D4 可通过靶向 miR-590-5p/TIMP3 轴抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，在体内实验中也展现出显著的抑癌效果，且无明显毒性。这一研究成果为肝癌的治疗提供了新的潜在靶点和治疗策略，在肝癌治疗领域具有重要的意义，相关研究成果发表在《Molecular Cancer》杂志上。

研究人员在本次研究中运用了多种关键技术方法。临床样本方面，收集了 90 对肝癌原发性肿瘤和癌旁非肿瘤组织样本。实验技术上，采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测基因表达水平；通过 RNA 免疫沉淀（RIP）实验验证 circDCUN1D4 与 AGO2 的相互作用；构建双荧光素酶报告基因载体，进行双荧光素酶报告基因实验，验证 circDCUN1D4 与 miR-590-5p、miR-590-5p 与 TIMP3 的靶向关系；此外，还运用了细胞增殖、迁移、侵袭、周期和凋亡等相关实验，以及动物实验来探究 circDCUN1D4 的功能。

研究结果如下：

1. circDCUN1D4 在肝癌中的表达分析：研究人员对 90 对肝癌组织和癌旁非肿瘤组织进行 RT-qPCR 检测，发现 circDCUN1D4 在肝癌组织中显著下调，且其表达与 TNM 分期相关。对 60 例患者的随访记录显示，circDCUN1D4 表达水平较高的患者生存率更好。同时，与正常人类肝上皮细胞相比，肝癌细胞系中 circDCUN1D4 表达水平更低。通过多种实验方法，研究人员还确定了 circDCUN1D4 的生成方式、结构稳定性及其在细胞中的定位，结果表明 circDCUN1D4 位于细胞质中。

2. circDCUN1D4 对肝癌进展的影响：在体外实验中，研究人员通过转染质粒或小干扰 RNA（siRNA）分别过表达或敲低肝癌细胞中的 circDCUN1D4。细胞计数试剂盒 - 8（CCK8）实验、5 - 乙炔基 - 2’- 脱氧尿苷（EdU）实验和集落形成实验结果表明，过表达 circDCUN1D4 可显著抑制肝癌细胞生长，而敲低 circDCUN1D4 则促进细胞生长。伤口愈合实验显示，过表达 circDCUN1D4 可降低细胞迁移率，敲低则加速细胞迁移。细胞周期和凋亡实验表明，过表达 circDCUN1D4 可使细胞周期阻滞在 G₂期并促进细胞凋亡，敲低则产生相反效果。在体内实验中，将过表达或敲低 circDCUN1D4 的肝癌细胞接种到 NCG 小鼠体内，结果显示过表达 circDCUN1D4 可显著抑制肿瘤生长，敲低则促进肿瘤生长。这些结果表明 circDCUN1D4 在肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程中起着关键的调控作用。

3. circDCUN1D4 的作用机制：利用 CircInteractome 数据库和 RIP 实验，研究人员发现 circDCUN1D4 可能与 AGO2 相互作用，并通过交集筛选确定了 miR-21、miR-590-5p 和 miR-421 为潜在的靶 miRNA。进一步的实验表明，只有 miR-590-5p 在 circDCUN1D4 过表达时表达下调，敲低时表达上调。双荧光素酶报告基因实验和 Pearson 相关性分析证实了 circDCUN1D4 与 miR-590-5p 之间的相互作用。通过共转染实验，研究人员发现 miR-590-5p 模拟物可逆转 circDCUN1D4 过表达对肝癌细胞生长、迁移和侵袭的抑制作用，而 miR-590-5p 抑制剂则可抵消敲低 circDCUN1D4 的促进作用。这些结果表明 circDCUN1D4 通过作为 miR-590-5p 的海绵来抑制肝癌的进展。

4. TIMP3 是 miR-590-5p 的直接靶点：研究人员运用 RNA 测序（RNA-seq）技术筛选 miR-590-5p 的潜在下游靶基因，通过与预测的靶基因重叠分析，确定了 TIMP3 等 3 个候选基因。RT-qPCR 分析显示，在肝癌细胞中过表达或敲低 circDCUN1D4 和 miR-590-5p 时，TIMP3 的表达变化显著。双荧光素酶报告基因实验证实了 miR-590-5p 可直接结合 TIMP3 的 3’非翻译区（3’UTR）。此外，研究人员还通过蛋白质免疫印迹（western blot）实验发现，circDCUN1D4 可通过调控 miR-590-5p/TIMP3 轴影响相关蛋白的表达，进而抑制肿瘤的迁移和侵袭。

5. circDCUN1D4 通过 miR-590-5p/TIMP3 通路抑制肝癌细胞增殖和转移：一系列的拯救实验表明，TIMP3 沉默可抵消 circDCUN1D4 过表达对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，而同时过表达 TIMP3 则可挽救敲低 circDCUN1D4 对细胞增殖和迁移的促进作用。这些结果进一步证实了 circDCUN1D4 通过调控 miR-590-5p/TIMP3 信号通路来抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移。

6. circDCUN1D4 的体内抗肿瘤效果和安全性评估：在体内实验中，将过表达 circDCUN1D4 的肝癌细胞接种到 NCG 小鼠体内，通过瘤内和尾静脉注射 circDCUN1D4 与体内 jet-PEI 的混合物，发现 circDCUN1D4 可显著抑制肿瘤生长，且对小鼠体重无明显影响。通过 RT-PCR 检测 circDCUN1D4 在肿瘤组织中的表达，以及进行苏木精 - 伊红（HE）染色和免疫组化（IHC）染色，进一步证实了 circDCUN1D4 的抑癌作用。在安全性评估实验中，对正常 BALB/c 小鼠尾静脉注射 circDCUN1D4，结果显示 circDCUN1D4 对小鼠器官无明显损伤，也未引起明显的免疫反应。

研究结论和讨论部分指出，本研究揭示了 circDCUN1D4 在肝癌发展中的重要作用及其潜在机制，circDCUN1D4 通过靶向 miR-590-5p/TIMP3 轴抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，在体内实验中展现出显著的抗肿瘤效果且无明显毒性，这使其成为肝癌治疗的一个有前景的候选靶点。然而，目前仍存在一些局限性，如样本量相对较小、缺乏直接的临床证据、circDCUN1D4 的免疫原性、体内稳定性和长期毒性尚未充分表征等。未来需要进一步开展大规模、多中心的研究，优化 circDCUN1D4 的给药方式和剂量方案，以推动其在临床治疗中的应用。总体而言，该研究为肝癌的治疗提供了新的思路和潜在的治疗靶点，对肝癌治疗领域的发展具有重要的推动作用。