创新双基因递送平台：脐带间充质干细胞与外泌体共载 miR-124 和 PD-1 治疗胶质母细胞瘤

《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》：Innovative dual-gene delivery platform using miR-124 and PD-1 via umbilical cord mesenchymal stem cells and exosome for glioblastoma therapy

胶质母细胞瘤（GBM）治疗面临靶点难寻和递送策略不佳的困境。研究人员开展了利用脐带间充质干细胞（UMSCs）和外泌体递送 miR-124 和 PD-1 的研究，结果显示该双基因递送系统能抑制肿瘤生长、调节免疫，为 GBM 治疗带来新希望。

　　胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM）作为成人中最为常见且极具侵袭性的恶性脑肿瘤，严重威胁着人们的生命健康。目前，针对 GBM 的标准治疗方案是手术切除、放射治疗和化学治疗相结合的多模式疗法，但由于血脑屏障（Blood-Brain Barrier，BBB）的存在，使得许多治疗药物难以有效抵达肿瘤部位，治疗效果并不理想。同时，GBM 的肿瘤细胞具有高度异质性，存在多种复杂的信号通路异常，缺乏单一有效的治疗靶点，导致传统的单药治疗或局部治疗往往无法取得令人满意的效果。而且，GBM 还具有较强的免疫逃逸能力，被归类为 “冷肿瘤”，免疫细胞浸润较少，使得免疫治疗单独使用时效果不佳。在这样的背景下，开发新的治疗策略迫在眉睫。

中国台湾的研究人员针对上述问题展开了一项重要研究。他们致力于构建一种创新的非病毒双基因递送平台，利用脐带间充质干细胞（Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，UMSCs）及其外泌体，将具有肿瘤抑制特性的微小核糖核酸 - 124（MicroRNA-124，miR-124）和程序性细胞死亡蛋白 - 1（Programmed Cell Death Protein-1，PD-1）输送到肿瘤部位，以期为 GBM 的治疗提供新的方案。研究结果表明，该双基因递送系统能够有效诱导 GBM 细胞凋亡，显著抑制肿瘤生长，同时对正常神经胶质细胞的细胞毒性极小，展现出良好的安全性和选择性。此外，该系统还具有免疫调节特性，能够增强免疫细胞如 T 细胞和树突状细胞的激活，减少调节性 T 细胞（Regulatory T Cells，Tregs）和髓源性抑制细胞（Myeloid-Derived Suppressor Cells，MDSCs）等免疫抑制细胞的数量，为 GBM 的治疗带来了新的希望。这项研究成果发表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》上。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，从台北医学大学附属医院获取了人类胶质瘤标本，并利用来自癌症基因组图谱计划（The Cancer Genome Atlas Program，TCGA）的样本进行分析。然后，通过构建 PiggyBac（PB）转座子 miR-124/PD-1 质粒，并将其转染到 UMSCs 中。接着，采用特定方法分离和鉴定 UMSCs 分泌的外泌体。此外，建立了原位 GBM 小鼠模型，通过颈动脉注射（Intra Carotid Artery Injection，ICA）等方式对小鼠进行治疗，并利用多种检测技术，如蛋白质免疫印迹法（Western blot assay）、流式细胞术（Flow Cytometry）等，对治疗效果进行评估。

研究结果具体如下：

1. miR-124 是 GBM 中 CDK4/CDK6 的潜在靶点：通过对 GBM 样本的 RNA 微阵列分析、数据库数据验证以及蛋白质和 RNA 水平的分析，发现细胞周期蛋白依赖性激酶 4（CDK4）和细胞周期蛋白依赖性激酶 6（CDK6）在 GBM 中高表达，且与患者不良生存结局相关。利用生物信息学工具预测并验证了 miR-124 与 CDK4/CDK6 的靶向关系，同时发现 miR-124 在 GBM 细胞中低表达。
2. 提高 miR-124 表达可抑制 GBM 进展：将 miR-124 模拟物转染到 GBM 细胞中，发现能够降低 CDK4、CDK6 和细胞周期蛋白 D1（Cyclin D1）等蛋白的表达，抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力，促进细胞凋亡，同时下调关键转移相关蛋白的表达，抑制免疫抑制因子的表达，表明 miR-124 可能通过靶向 STAT3/NF-κB 信号通路调节 GBM 进展。
3. UMSCs 介导的 miR-124 和 PD-1 双基因递送系统可诱导 GBM 细胞凋亡：成功构建了基于 PiggyBac 转座子的双基因递送系统，并验证了转染后 UMSCs 中 PD-1 和 miR-124 的表达。通过细胞共培养实验发现，UMSC/miR-124-PD-1 能够诱导 GBM 细胞凋亡，使细胞周期阻滞在 G1 期。
4. UMSC/miR-124-PD-1 来源的外泌体可诱导 GBM 细胞凋亡：从 UMSCs 及其基因修饰的细胞中分离出外泌体，验证了其作为外泌体的特征。与外泌体共培养实验表明，UMSC/miR-124-PD-1 来源的外泌体能够抑制 GBM 细胞的集落形成，诱导细胞凋亡，且对正常神经胶质细胞无明显毒性。
5. UMSC/miR-124-PD-1 的靶向性和生物分布：通过 Transwell 实验和伤口愈合实验证实了 UMSCs 具有向 GBM 细胞迁移的能力。利用放射性标记和荧光标记技术发现，UMSC/miR-124-PD-1 能够通过 ICA 注射有效浸润到 GBM 部位，并在肿瘤部位积累，减少在其他器官的不必要分布。
6. UMSC/miR-124-PD-1 及其外泌体对 GBM 的有效抑制：在 GBM 小鼠模型中，通过 ICA 注射和静脉注射给予 UMSC/miR-124-PD-1 及其外泌体，结果显示能够显著抑制肿瘤生长，延长小鼠生存时间，且未引起明显的全身毒性和器官病理改变。在肿瘤组织中，miR-124 的靶蛋白表达降低，增殖标记物 Ki-67 表达减少，凋亡标记物 Cleaved Caspase-3 表达增加。
7. UMSC/miR-124-PD-1 及其外泌体的免疫调节作用：体外实验表明，UMSC/miR-124-PD-1 与外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs）共培养能够增加 CD4、CD8 和 CD86 等免疫细胞的数量，促进记忆 T 细胞的积累，增强 CD8? T 细胞的增殖能力。体内实验发现，该双基因递送系统及其外泌体能够激活肿瘤引流淋巴结（Tumor-Draining Lymph Nodes，TDLN）和脾脏中的免疫细胞，增加肿瘤浸润免疫细胞的数量，同时减少 Tregs、MDSCs 和 M2 型巨噬细胞等免疫抑制细胞的数量，有效调节肿瘤微环境的免疫状态。

研究结论和讨论部分指出，目前 GBM 的标准治疗方案仅能使患者的中位生存期达到 12 - 15 个月，迫切需要创新的治疗策略。本研究成功开发了一种创新的生物材料递送平台，利用 UMSCs 进行双基因治疗，为 GBM 的治疗提供了新的方向。UMSCs 及其外泌体具有天然的肿瘤浸润能力，能够将治疗基因直接输送到肿瘤部位。同时，miR-124 和 PD-1 的联合递送不仅能够抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭，还能调节肿瘤微环境的免疫状态，增强机体的抗肿瘤免疫反应。然而，目前的研究仍存在一定的局限性，未来需要进一步优化双基因递送系统，提高其治疗效果和安全性，并开展更多的临床研究，以验证该治疗策略在人体中的有效性和可行性。总之，这项研究为 GBM 的治疗带来了新的希望，有望为改善 GBM 患者的预后提供重要的理论依据和实践指导。