高效多重编辑与基因分型：解锁玉米功能基因组学新密码

《Plant Methods》：Efficient mutagenesis and genotyping of maize inbreds using biolistics, multiplex CRISPR/Cas9 editing, and Indel-Selective PCR

为解决玉米多重基因组编辑的难题，研究人员开展 CRISPR/Cas9 编辑及相关研究，成功实现编辑并开发新方法，推动玉米研究发展。

　　

玉米基因组编辑的探索之旅：突破难题，开启新篇

在农业的大舞台上，玉米无疑是一颗璀璨的明星，作为全球谷物生产的领军者，每年产量超十亿吨。随着玉米基因组数据和功能基因组学资源的不断涌现，科学家们发现了众多可用于提升玉米产量和品质的新靶点。而 CRISPR/Cas9 技术的出现，就像一把神奇的 “基因剪刀”，为精准编辑玉米基因带来了希望。

然而，在实际应用中，这把 “剪刀” 却遇到了不少挑战。多重基因组编辑面临着重重困难，比如构建复杂的 DNA 大片段、仅有少数基因型具备高效转化系统，以及成本高昂、耗费人力的基因分型方法。这些问题就像一道道屏障，阻碍着玉米基因组编辑技术的发展。为了突破这些障碍，来自美国伊利诺伊大学厄巴纳 - 香槟分校（University of Illinois at Urbana-Champaign）和美国能源部先进生物能源与生物产品创新中心（DOE Center for Advanced Bioenergy and Bioproducts Innovation）的研究人员展开了深入研究。

研究人员致力于开发一种高效的多重 CRISPR/Cas9 基因组编辑系统，旨在克服现有技术的局限，为玉米功能基因组学研究开辟新道路。他们的研究成果发表在《Plant Methods》杂志上，为玉米基因组编辑领域带来了新的曙光。

研究人员在研究中运用了多种关键技术方法。首先，利用生物信息学工具设计引导 RNA（gRNA），并通过 GoldenGate 克隆系统构建表达载体。然后，采用生物弹轰击法将编辑组件导入玉米 I 型胚性愈伤组织。此外，还通过体外 Cas9 核糖核蛋白（RNP）消化实验验证 gRNA 功能，利用 Illumina 深度测序检测脱靶突变，运用 Indel - 选择性 PCR（IS-PCR）技术对编辑突变进行基因分型。

研究结果如下：

• DNA 设计与验证：设计了针对玉米 Lemon White1（LW1）基因的多重编辑 DNA，将四个 gRNA 组装到 pMOD_B2103 载体中，并通过体外 Cas9 RNP 切割实验验证了其编辑功能。
• 基因编辑成功实现：运用生物弹轰击法对 H99 和 ILP1 玉米自交系进行 LW1 基因编辑，成功获得转基因事件，且编辑频率可观。通过 PCR 和测序分析，证实了在多个 gRNA 靶位点产生了不同类型的突变。
• 基因家族编辑成果显著：以氮转运蛋白 NRT1.1 基因家族为目标进行编辑，设计三个 gRNA，成功在 H99 玉米中实现多重编辑，获得多种突变类型，且部分突变可遗传至 T1 代。
• 脱靶突变情况：对 NRT1.1 编辑事件进行基因组测序，发现脱靶突变罕见，仅在 NRT1.1D 基因区域检测到一处可能的脱靶编辑。
• 新基因分型方法有效：设计并验证了 Indel - 选择性 PCR（IS-PCR）方法，能够有效识别和追踪小的插入 / 缺失（Indel）突变，且可用于大规模后代群体的基因分型。

在研究结论和讨论部分，研究人员开发的多重 CRISPR/Cas9 编辑系统及 IS-PCR 基因分型方法，为玉米基因组编辑提供了一种高效、简便且经济的策略。该系统通过生物弹轰击法将紧凑的单 DNA 片段导入 I 型胚性愈伤组织，实现了多个基因或基因家族的同时编辑，且脱靶效应低。IS-PCR 方法能够快速、低成本地筛选和追踪编辑突变，尤其适用于单碱基 Indel 突变的检测。此外，该研究成功对从未被转化过的 ILP1 自交系进行了编辑，拓展了玉米基因组编辑的应用范围。这些成果不仅为玉米功能基因组学研究提供了有力工具，也为玉米遗传改良和育种实践奠定了坚实基础，推动了玉米基因组编辑技术在农业领域的广泛应用。