孟加拉国农场动物抗菌药物耐药性研究：现状、挑战与应对

《Discover Bacteria》：Uncovering antimicrobial resistance patterns in Pseudomonas aeruginosa and Enterococcus faecalis isolated from farm animals in Bangladesh

这篇研究聚焦孟加拉国农场动物，发现粪肠球菌（Enterococcus faecalis）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）耐药情况严重。66.66% 的粪肠球菌和 23.52% 的铜绿假单胞菌呈多药耐药（MDR），还检测到多种耐药基因。研究为防控抗菌药物耐药性（AMR）提供关键数据，意义重大。

　　

1 引言

抗菌药物耐药性（Antimicrobial Resistance，AMR）是全球严峻的健康问题，严重影响人类和兽医医学。农场动物中耐药菌株的出现和传播，不仅威胁动物健康，还可能通过人畜共患病传播影响人类健康。

机会致病菌铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和共生指示菌粪肠球菌（Enterococcus faecalis）因能对多种抗生素产生耐药性，使感染治疗困难并传播耐药基因，备受关注。铜绿假单胞菌可引发免疫功能低下动物的肺炎、尿路感染等多种感染，其在环境中生存能力强，能形成生物膜，导致慢性感染，增加治疗难度，还存在人畜共患病传播风险。粪肠球菌通常栖息于胃肠道，有助于肠道健康，但在特定条件下会致病，引发尿路感染、心内膜炎等。它易获得抗生素耐药性，形成多药耐药菌株，通过食物链或直接接触传播给人类，威胁公共卫生。

孟加拉国作为中低收入国家，农业在经济中占重要地位，畜牧业至关重要。然而，该国畜牧业中抗生素的过度使用和不当处理，导致耐药菌株增加，迫切需要有效策略控制和减少 AMR。虽然已有研究调查了包括牛乳腺炎样本中粪肠球菌的 AMR 模式，但对孟加拉国农场动物中铜绿假单胞菌的 AMR 模式研究较少。本研究旨在调查孟加拉国农场动物中铜绿假单胞菌和粪肠球菌的流行情况，分析其表型和基因型抗菌耐药模式，为制定生物防控策略、加强 AMR 监测和管控抗生素使用提供依据。

2 材料和方法

2.1 研究区域和设计

本研究为横断面研究，于 2023 年 10 月至 2024 年 6 月在孟加拉国达卡和巴里萨尔的养牛场开展，实验室工作在达卡萨瓦尔的孟加拉国畜牧研究实验室 AMR 参考实验室进行，旨在确定铜绿假单胞菌和粪肠球菌的流行率，分析其抗菌耐药模式。

2.2 样本采集

从达卡和巴里萨尔的养牛场共采集 158 份样本，包括直肠拭子、粪便、伤口拭子、土壤和水。采样时采用无菌技术，样本标记唯一标识符，在采集后 6 小时内于凉爽环境中运输，保持样本完整性，并在运输全程维持冷链。样本收集在营养肉汤中，分析前预富集培养 24 小时。

2.3 铜绿假单胞菌和粪肠球菌的分离与鉴定

铜绿假单胞菌的分离遵循国际标准（ISO/TS 21872 - 1:2007），使用选择性琼脂（如十六烷基三甲基溴化铵琼脂）在 37°C 培养过夜，通过黄色 - 绿色至蓝色菌落特征进行初步鉴定。粪肠球菌则在胆汁七叶苷琼脂上培养，根据培养基中七叶苷和胆盐反应形成的深棕色至黑色菌落确认其存在。分离后的菌株使用 VITEK?2 系统进一步确认，依据特定生化特征确定是否为目标菌株。

2.4 抗生素敏感性测试

采用纸片扩散法，依据临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）及相关指南，对铜绿假单胞菌和粪肠球菌分离株进行抗生素敏感性测试。针对粪肠球菌，测试了包括氨苄西林（AMP）、青霉素（PEN）等 13 种抗生素；针对铜绿假单胞菌，测试了阿米卡星（AMK）、头孢他啶（CAZ）等 10 种抗生素。严格按照标准制备培养基、接种物和应用抗菌纸片，使用自动抑菌圈测量仪依据 CLSI 指南测量抑菌圈大小。

2.5 多药耐药（MDR）分离株的分组

将每个采样点对超过三类抗生素耐药的分离株归类为多药耐药分离株。

2.6 粘菌素耐药最低抑菌浓度（MIC）的测定

使用标准琼脂稀释法测定粘菌素耐药的 MIC。按照制造商说明制备抗菌剂储备液，冷冻保存，使用前小心解冻。将储备液进行系列稀释，制备不同浓度梯度（如 0.5 μg/mL 至 64 μg/mL）。培养细菌制备菌悬液，调整浊度至 0.5 麦氏标准，再稀释至 10⁴ CFU/mL。将不同浓度抗生素溶液与 MHA 培养基混合，接种菌悬液，在 37°C 孵育 16 - 20 小时后记录 MIC 读数。

2.7 DNA 提取

对于铜绿假单胞菌，采用常规煮沸法提取 DNA。取 1500 μL 过夜培养物离心，弃上清，将沉淀与 200 μL 蒸馏水混合，在 96 - 98°C 水浴中孵育 10 分钟，再次离心后取上清转移至新管，于 - 20°C 保存。对于粪肠球菌，使用 QIAamp DNA 微型试剂盒按照制造商协议提取 DNA。

2.8 抗生素耐药基因的扩增

使用 Thermocycler（2720 Thermal Cycler，Applied Biosystems，美国）进行 PCR 反应，扩增粪肠球菌和铜绿假单胞菌分离株中的抗生素耐药基因。反应体系总体积 25 μL，包含 Dream Taq PCR Master Mix、引物、模板 DNA 和去离子水。使用特定引物检测 9 种耐药基因（bla_{CTX - M}、bla_{NDM - 1}、bla_{NDM - 5}、bla_{OXA - 1}、bla_{OXA - 48}、*VIM - 1、vanB、qnrS、*mcr - 1），PCR 反应条件包括初始变性、循环变性、退火和延伸，以及最终延伸，具体温度、时间和引物信息详见补充部分。

2.9 伦理声明

本研究遵循 ARRIVE 指南，保障参与者福利和完整性。研究方案经孟加拉国畜牧研究所伦理审查委员会审核批准，严格遵守国家和国际生物样本处理伦理标准，确保研究过程规范、透明。

2.10 统计分析

使用 Microsoft Excel 对数据进行清洗、编码和整理，然后将处理后的数据导入 R 编程语言，计算频率、百分比和相关性等描述性统计数据。

3 结果

3.1 铜绿假单胞菌和粪肠球菌的流行率

在 158 份样本中，铜绿假单胞菌阳性分离株有 17 份，占比 10.75%；粪肠球菌阳性分离株有 24 份，占比 15.18%。

3.2 AST 结果

对 17 份铜绿假单胞菌阳性分离株进行 10 种常用抗生素敏感性测试，结果显示其对抗生素的耐药、中介和敏感反应差异显著。23.52% 的分离株表现为 MDR，美罗培南敏感性最高，达 100%，庆大霉素和亚胺培南敏感性为 94.12%，阿米卡星和头孢吡肟为 88.24%。替加环素耐药率最高，为 35.29%，哌拉西林中介反应显著，为 58.82%。

对 24 份粪肠球菌分离株进行 13 种常用抗生素敏感性测试，66.66% 的分离株表现为 MDR。头孢呋辛耐药率最高，为 70.83%，青霉素为 66.67%，替加环素耐药率最低，为 12.50%，同时其敏感性最高，为 70.83%。青霉素敏感性最低，为 0%。此外，还通过热图分析发现，铜绿假单胞菌中，环丙沙星和亚胺培南、美罗培南和左氧氟沙星的耐药模式存在强相关性；粪肠球菌中，氯霉素和环丙沙星、头孢西丁和头孢呋辛的耐药模式存在强相关性。

3.3 MIC 结果

17 份铜绿假单胞菌分离株的 MIC 结果显示，4 份（23.53%）对粘菌素耐药（MIC≥4 μg/mL），3 份（17.65%）中介（MIC = 2 μg/mL），5 份（29.41%）MIC 为 1 μg/mL，5 份（29.41%）MIC≤0.5 μg/mL，后两者被归类为敏感。粪肠球菌分离株均对粘菌素无耐药性。

3.4 表型和基因型耐药模式

分析铜绿假单胞菌和粪肠球菌分离株的表型和基因型耐药模式，结果显示在铜绿假单胞菌的 17 份分离株中，mcr - 1基因检出率为 21.05%，bla_{NDM - 1}、bla_{NDM - 5}和bla_{OXA - 1}基因未检出。在粪肠球菌的 24 份分离株中，bla_{CTX - M}基因检出率为 41.66%，VIM - 1为 12.5%，bla_{OXA - 48}为 25%，bla_{NDM - 1}为 8.3%，vanB、bla_{OXA - 1}、qnrS、bla_{NDM - 5}和 * mcr - 1基因均未检出。

4 讨论

本研究揭示了孟加拉国农场动物中铜绿假单胞菌和粪肠球菌的流行情况及显著的表型和基因型耐药模式，与以往不同环境下的研究结果相符，表明农业环境中抗生素耐药问题普遍且持续存在。

铜绿假单胞菌在本研究中的流行率为 10.75%，虽相对较低但仍不容忽视，反映其作为机会致病菌在农场动物中的作用。此前埃及的研究报告农场动物中该菌流行率更高，提示其在管理不善的农场环境中易滋生。铜绿假单胞菌在农场的存在，表明其在动物和农场环境中传播，对动物和人类健康构成威胁，凸显加强生物安全措施和监测的重要性。

本研究中铜绿假单胞菌对美罗培南 100% 敏感，与临床研究结果一致，美罗培南对铜绿假单胞菌感染疗效显著。该菌对替加环素 35.29% 的耐药率与中国相关研究中家畜铜绿假单胞菌分离株的耐药情况相似。不同研究中美罗培南活性存在差异，可能与研究环境和样本来源不同有关。铜绿假单胞菌中，环丙沙星和亚胺培南、美罗培南和左氧氟沙星耐药模式的强相关性，可能源于潜在的共同耐药途径，但还需进一步分子研究证实。

孟加拉国畜牧业中抗生素的过度使用和滥用，以及监管不力，是导致高 AMR 流行率的重要因素。抗生素常被用于治疗、促进生长和预防疾病，促使耐药菌株产生和传播。特定耐药基因（如bla_{CTX - M}和mcr - 1）的存在，表明耐药元件在细菌群体中水平转移，这与动物和环境的密切接触以及质粒等移动遗传元件的传播有关。尽管孟加拉国已禁止在食用动物和饲料中使用粘菌素，但铜绿假单胞菌中mcr - 1基因的存在，提示耐药基因在农场和环境中持续传播，政府需加强监管，防控耐药基因扩散。

粪肠球菌在本研究中的流行率为 15.18%，与类似研究相符。其作为胃肠道共生菌和机会致病菌，在农场动物中普遍存在。不良卫生习惯和抗生素滥用，加上其适应环境和抵抗不利因素的能力，促进了粪肠球菌的持续存在和传播，使其成为 AMR 基因的潜在储存库，威胁公共卫生。

粪肠球菌对头孢呋辛（70.83%）和青霉素（66.67%）的高耐药率，与其他地区研究结果一致，表明这是全球性问题。氯霉素和环丙沙星、头孢西丁和头孢呋辛耐药模式的强相关性，可能与遗传因素导致的共同耐药机制有关，但需进一步研究。替加环素对粪肠球菌耐药率低（12.50%）且敏感性高（70.83%），在印度和巴西的研究中也显示出对多药耐药粪肠球菌的高疗效，表明其在治疗中的潜力。

粪肠球菌中bla_{CTX - M}（41.66%）和bla_{OXA - 48}（25%）等耐药基因的检出率，与其他地区研究相似，而Van - B和mcr - 1基因的缺失也符合以往研究结果。

本研究结果对公共卫生和农业实践意义重大。农场动物中高 AMR 流行率威胁动物和人类健康，耐药感染治疗困难，依赖有限的有效抗生素，迫切需要替代治疗方法。

4.1 研究局限性

本研究虽遵循国际指南进行实验，但横断面设计无法确定因果关系和追踪耐药模式的时间趋势。资金限制导致未检测所有可能的耐药基因，且未进行表型 ESBL 生产测试。未来研究应扩大样本规模，涵盖更广泛地理区域，研究移动遗传元件与耐药基因的关联，开展更全面的耐药基因检测和 ESBL 生产测试。

5 结论

本研究表明孟加拉国农场动物中多药耐药细菌流行率高，粪肠球菌对常用抗生素尤其是头孢呋辛和青霉素耐药显著。铜绿假单胞菌在农场环境中的存在令人担忧，虽其与医院分离株的克隆关系未知，但全基因组测序可助于确定。铜绿假单胞菌中mcr - 1基因的检测，表明粘菌素耐药基因在农场环境中持续传播。因此，孟加拉国急需全面、深入的监测项目，以监控 AMR 模式和基因传播途径。