可视化表观遗传修饰新突破：位点特异性 BiAD 传感器助力生命科学研究

《BIOspektrum》：Sensoren zur lokusspezifischen Visualisierung epigenetischer Modifikationen

为解决无法在活细胞中位点特异性检测表观基因组修饰问题，研究人员开发 BiAD 传感器，可检测多种修饰，助力相关研究。

　　

表观遗传修饰研究新进展：BiAD 传感器的创新与应用

在人体中，细胞的多样性背后有一个神秘的 “操控手”—— 表观遗传过程。它通过对 DNA 和组蛋白进行化学修饰，如甲基化、乙酰化等，决定着基因组特定区域是被激活还是抑制，进而调控基因表达。在细胞发育过程中，表观基因组会动态变化，塑造细胞的独特表型。而在疾病状态下，尤其是癌症等重大疾病，表观基因组修饰模式的异常改变十分常见，这些变化往往与细胞功能的严重紊乱以及细胞身份的改变紧密相关，直接影响疾病的发生、发展。

为了深入了解这些隐藏在细胞深处的表观遗传奥秘，科学家们一直在努力探索。过去，基于测序的技术，像亚硫酸氢盐转化后测序分析 DNA 甲基化，以及染色质免疫沉淀后高通量测序（ChIP-seq）研究组蛋白修饰，虽然让我们对表观基因组有了更深入的认识，但这些技术存在明显的缺陷。它们就像给细胞拍了一张静态照片，只能捕捉到某一时刻的表观基因组状态，而且在检测过程中必须破坏细胞，无法将细胞表型与表观基因组修饰联系起来。另外，一些在活细胞中研究表观基因组的方法，比如基于荧光标记的细胞内抗体或染色质阅读结构域的方法，虽然能在一定程度上检测修饰，但却无法提供单个基因组位点的修饰信息。

在这样的研究困境下，德国斯图加特大学（University of Stuttgart）的研究人员决心开辟新的研究道路。他们聚焦于开发能够在活细胞中对特定基因组位点的表观基因组修饰进行检测的技术，经过不懈努力，双分子锚定探测器（Bimolecular Anchor Detector，BiAD）传感器应运而生。这项研究成果发表在《BIOspektrum》上，为表观遗传领域的研究带来了新的曙光。

研究人员在开发 BiAD 传感器时，运用了多种关键技术方法。其中，核心技术是将靶向特定基因组位点的 DNA 结合锚定模块（如 sgRNA/dCas9 复合物）与作为检测模块的染色质阅读结构域相结合，用于特异性检测表观基因组修饰。同时，为了提高传感器的灵敏度，还整合了 SunTag 和 MS2 两种信号放大系统。此外，通过构建双阅读结构域的检测模块，实现了对多种组蛋白修饰的可视化检测。

下面让我们详细了解一下 BiAD 传感器的研究成果。

1. 双色 BiAD 传感器提升 DNA 甲基化检测灵敏度：第一代 BiAD 传感器在实际应用中存在局限性，其基于显微镜的检测依赖于每个 sgRNA/dCas9 结合位点上单个重新组装的荧光团，这就意味着只有在高重复的基因组区域才能产生可检测的信号，而大多数具有生物学意义的基因组区域并非如此。为了突破这一限制，研究人员对 BiAD 传感器进行升级。第二代双色 BiAD 传感器结合了两种信号放大系统，SunTag 系统使得每个 sgRNA/dCas9 结合位点能够重新组装多个荧光团，增强了 BiAD 信号；MS2 系统则招募多个第二种颜色的荧光团，用于识别目标位点。这种创新设计显著提高了传感器的灵敏度，研究人员首次实现了对低重复区域（仅 45 个局部拷贝）DNA 甲基化的定量检测。实验中，通过转染双色 BiAD 传感器到细胞中，利用标记荧光团（YPet）标记内源性目标区域，实现对 BiAD 信号（IFP2.0）的准确定量。同时，以结合突变体（M）作为阴性对照，结果显示突变体在目标位点没有 BiAD 信号，而野生型（WT）则有明显信号，这充分验证了双色 BiAD 传感器的功能。此外，研究人员抑制负责细胞分裂后维持甲基化的 DNA 甲基转移酶 1（DNMT1），发现 BiAD 信号显著降低，这表明双色 BiAD 传感器能够捕捉 DNA 甲基化的动态变化。
2. 双阅读结构域实现组蛋白修饰检测：研究人员进一步拓展了 BiAD 传感器的应用范围，通过在检测模块中使用双阅读结构域，首次在人类细胞中实现了对三种重要组蛋白修饰的可视化检测，分别是组蛋白 H3 赖氨酸 9 的二甲基化和三甲基化（H3K9me₂/3）、组蛋白 H3 赖氨酸 27 的三甲基化（H3K27me₃）以及组蛋白 H3 赖氨酸 36 的二甲基化和三甲基化（H3K36me₂/3）。以雌性哺乳动物细胞中的 X 染色体失活过程为例，在这个过程中，一条 X 染色体在早期胚胎发育中会被沉默，失活的 X 染色体（Xi）上会特异性地积累抑制性的表观基因组修饰，如 H3K27me₃和 H3K9me₃。研究人员利用改进后的检测模块，成功在活细胞中检测到 Xi 上 H3K27me₃和 H3K9me₂/3 的特异性富集，而在活性 X 染色体上则没有检测到。此外，研究人员利用双色 H3K9me₂/3 BiAD 传感器，对五种主要的人类 H3K9 蛋白赖氨酸甲基转移酶（H3K9-PKMTs）进行单独敲低实验，发现敲低 G9a 和 GLP 这两种 PKMT 会导致 Xi 上 H3K9me₂/3 BiAD 信号下降，这表明这两种甲基转移酶在 Xi 上特定位点的 H3K9me₂/3 修饰中起着关键作用。
3. 双色 BiAD 传感器的应用前景：BiAD 技术的这些改进为未来的研究开辟了广阔的前景。在人类发育研究中，双色 BiAD 传感器可用于更精确地研究 Xi 上抑制性表观基因组修饰在空间和时间上的积累过程，有助于揭示早期胚胎发育中细胞命运决定的表观遗传机制。在癌症研究领域，BiAD 传感器也具有巨大的应用潜力。例如，CDH4 基因编码视网膜钙粘蛋白（R-Cadherin），钙粘蛋白是细胞间粘附和信号传导的关键调节因子，在癌症进展过程中常常出现调节异常，与肿瘤转移密切相关。由于 R-Cadherin 的作用机制尚不完全清楚，BiAD 传感器有望为深入了解其在癌症发生发展中的作用提供重要线索。而且，BiAD 传感器与活细胞显微镜技术的兼容性是其相对于基于测序的单细胞方法的独特优势，它能够在异质细胞群体中研究不同表观基因组修饰的位点特异性时间动态变化，并将结果与细胞表型的实时观察相结合。随着更多用于检测活性表观基因组修饰（如组蛋白乙酰化）的检测模块的开发，双色 BiAD 传感器将为我们深入了解表观遗传过程提供更强大的工具。

总的来说，BiAD 传感器的开发和改进是表观遗传学研究领域的一项重大突破。它成功解决了长期以来在活细胞中位点特异性检测表观基因组修饰的难题，为我们深入了解细胞发育、疾病发生机制提供了有力的技术支持。未来，随着该技术的不断完善和拓展应用，有望在生命科学和健康医学领域取得更多重要的研究成果，为疾病的诊断、治疗和预防带来新的思路和方法。