综述：小孢子培养在作物改良中的技术与优势

《Plant Growth Regulation》：Techniques and advantages of microspore culture for crop improvement

该综述聚焦小孢子培养技术，阐述其在作物改良中的应用、优势、挑战及前景（DH）。

　　

小孢子培养在作物改良中的技术与优势

引言

单倍体植物含有一套染色体（n），是植物育种、遗传学研究的关键组成部分。利用双单倍体（DH）技术，育种者能加速纯合系的培育进程。在这个过程中，单倍体植物的染色体数目加倍，个体实现完全纯合。DH 技术为杂交品种的培育和复杂遗传性状的研究提供了重要优势，其单代纯合特性大大缩短了传统育种所需的时间。因此，单倍体和 DH 技术在当前许多谷物、蔬菜及其他重要作物的育种和改良中发挥着关键作用。

单倍体 / DH 植株可通过孤雌生殖、远缘杂交或染色体消除以及雄核发育或雌核发育产生。在这些方法中，小孢子培养或雄核发育是生产单倍体和 DH 植株最先进、高效的工具之一，受到全球研究人员的广泛关注。与花药培养不同，小孢子培养是将未成熟的小孢子从花药中分离出来，在体外可控条件下进行培养。这种分离操作具有诸多优势，它去除了可能阻碍小孢子发育并产生不需要的二倍体体细胞组织的花药壁；有利于营养物质的流动，便于调控发育条件，促进胚胎发生和植株再生；还能详细监测小孢子的成熟和胚胎发育过程，是研究植物细胞和分子发育的重要体系。

1964 年，Guha 和 Maheshwari 首次报道了通过花药培养诱导单倍体成功的案例，他们从曼陀罗花药培养中获得了单倍体胚胎，这为基于花药和小孢子培养的不同单倍体诱导方法的发展奠定了基础。尽管花药培养曾是产生单倍体的主要技术，但小孢子培养因其耗时短、工作量小、成功率高，逐渐成为更有效的方法。目前，小孢子培养已广泛应用于多种植物物种，许多作物的标准操作程序也已较为完善，包括大麦（Hordeum vulgare L.）、小麦（Triticum aestivum L.）、水稻（Oryza sativa L.）等谷物，芸薹属植物、茄子（Solanum melongena L.）、辣椒（Capsicum annuum L.）、芦笋（Asparagus officinalis L.）等。

小孢子培养主要用于培育纯合育种系，这对杂交种子的生产至关重要。杂交品种在产量、抗病性和抗逆性方面优于传统品种，通过小孢子培养产生 DH 植株，能够帮助育种者快速获得纯合亲本系。在具有商业杂交优势的作物，如芸薹属植物、小黑麦和水稻中，小孢子培养已成为新品种培育的必要环节。此外，小孢子培养还应用于基因组学、基因表达分析和遗传图谱构建等领域，其能够产生大量遗传相似的植物克隆，为研究植物基因的遗传特征和功能提供了便利途径。近年来，小孢子培养在技术上不断发展，如小孢子分离技术的改进、培养基的优化、分子标记筛选响应基因型等，都提高了小孢子胚胎发生的效率；小孢子的冷冻保存技术也取得进展，可长期保存遗传资源；同时，小孢子培养在基因工程领域的应用也在不断探索，有望培育出具有优良性状的转基因植物。

小孢子分离与培养技术

小孢子分离与培养过程在植物育种研究和遗传学中至关重要，它通过雄核发育产生单倍体植株，加速纯合系的培育，避免了多代等待，是育种计划的有力技术手段。

在操作过程中，首先要从发育中的花蕾中采集花药。对于油菜（Brassica napus）和小麦（Triticum aestivum）等作物，小孢子处于单核晚期至双核早期时，胚胎发生效果最佳。通过花蕾大小和颜色等形态学标记，可判断小孢子的发育阶段，确保采集的花药处于合适时期。在无菌条件下解剖花药，避免损伤小孢子，以保证其活力和胚胎发生潜力。

分离小孢子的方法主要有机械法和酶解法。机械法是在无菌培养基中挤压花药，再用细网过滤分离小孢子，但该方法容易造成细胞损伤，影响分离效果。酶解法使用纤维素酶和果胶酶，能够更温和地分离小孢子，提高其活力和胚胎发生能力。此外，利用 Percoll 或蔗糖梯度进行密度梯度离心，可进一步分离出有活力的小孢子，提高胚胎发生的成功率。

小孢子培养需要营养丰富的培养基，如 MS 培养基，并添加蔗糖或麦芽糖提供能量，添加氨基酸支持蛋白质合成。同时，根据不同物种需求，还会使用 NLN 和 B5 等培养基。优化的培养条件包括调节 pH 至 5.8 左右，控制温度和光照。在烟草等物种中，特定的激素，如 2,4 - D 和细胞分裂素，可促进胚胎发生，但需精确控制其浓度。

胚胎发生过程中，小孢子需要激活信号才能从配子体发育途径转变为孢子体发育途径。研究人员通常采用热激处理，如在油菜和小麦中，将植株置于 32 - 35°C 的环境中启动胚胎发生。对大麦进行 32°C、48 小时的热激处理，可改变小孢子的发育进程。不同物种也可能需要冷处理或渗透压等胁迫条件来诱导胚胎发生。

胚胎发生启动后，小孢子进行对称增殖，形成多细胞原胚，随后经历球形、心形和鱼雷形等发育阶段，与合子胚的发育过程相似。在营养溶液中减少植物生长调节剂的用量，有助于胚胎正常发育。施加脱落酸（ABA）或将胚胎转移到固体培养基上，可促进胚胎成熟，提高其活力。胚胎发育的时间因物种而异，通常为 1 - 4 周。

胚胎发育完成后，需将其转移到含有生长素（IAA）和细胞分裂素（BAP）的再生培养基中，诱导芽和根的发育。幼苗在移栽到土壤环境前，还需经过适应性处理。由于小孢子来源的植株为单倍体，可通过秋水仙素处理使其染色体加倍，获得纯合二倍体，用于育种计划。对谷物进行冷处理，也可能导致染色体自发加倍。利用流式细胞术和 DNA 标记等细胞遗传学技术，可进行倍性验证，提高育种效率，快速培育遗传稳定的植株系。

小孢子雄核发育的生物学机制

小孢子培养是一种先进的生物技术，利用小孢子的发育可塑性，在胁迫条件下诱导产生单倍体胚胎。小孢子是雄配子体减数分裂的单倍体产物，通常发育为花粉粒和雄配子，但在特定胁迫条件下，它们能够改变发育程序，从配子体途径转变为孢子体途径。

诱导小孢子胚胎发生的物理和化学胁迫包括热激、冷激、渗透压休克和化学处理等。这些胁迫处理会破坏小孢子的内稳态平衡，激活胁迫响应途径，重新规划其发育路径。在这个过程中，热休克蛋白（HSPs）发挥着关键作用，如 HSP70 和 HSP90 等伴侣蛋白，能够稳定蛋白质，控制蛋白质聚集，保护小孢子免受胁迫损伤，促进胚胎发生。

植物生长调节剂，如生长素和细胞分裂素，在小孢子胚胎发生早期也起着重要作用，它们参与调节细胞分裂和分化。植物激素吲哚 - 3 - 乙酸（IAA）和细胞分裂素玉米素，可通过控制细胞周期和信号通路，影响小孢子的发育潜力。在单子叶植物中，大麦（Hordeum vulgare）在生长素途径的控制下，是胁迫诱导小孢子胚胎发生（ME）的关键调节者。研究发现，胚胎发生需要生长素水平在胚胎形成初期上升，并在发育阶段持续增长。HvTAR2 - like 和 HvPIN1 - like 等与生长素相关的基因，在胚胎发育过程中表达模式与发育进程一致，干扰生长素的生物合成或运输会阻断胚胎发育，这表明调节生长素水平有助于提高体外胚胎生产的成功率。

在白菜（Brassica campestris L.）的研究中，外源施加 IAA 可显著促进胚胎发生，通过改变内源激素组成、增强营养积累、降低氧化应激，提高胚胎发生效率。转录组分析显示，IAA 处理后，生长素和赤霉素（GA）合成相关基因、细胞壁修饰和 ATP 生成基因活性增强，而 ABA 相关基因表达降低。这表明 IAA 通过影响激素平衡、能量代谢和氧化应激反应，加速了胚胎发生进程。

从配子体到孢子体的转变，需要对小孢子的转录组进行精确重编程，激活与细胞周期、胁迫和胚胎发生相关的基因。转录组学和蛋白质组学研究为理解这一过程的分子调控机制做出了重要贡献，发现了许多与胁迫相关的基因和蛋白质，以及参与氧化应激和细胞壁重塑的蛋白质，它们对小孢子胚胎发生起到正向调节作用。例如，超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶等基因和酶的抗氧化作用，能够保护小孢子免受损伤，促进胚胎发生。在冬小麦中，有效清除活性氧（ROS）和优化营养水平，可提高小孢子的耐受性，促进胚胎发生。低温预处理结合甘露醇和亚硒酸钠处理，在冬小麦育种中表现出良好的胚胎发生效果，为 DH 技术的发展提供了新途径。

此外，表观遗传调控，如 DNA 甲基化和组蛋白乙酰化，也在小孢子胚胎发生过程中调节基因表达。这些修饰能够开启或关闭胚胎发生所需的关键基因，决定小孢子的发育程序。研究表明，DNA 甲基化模式可调节关键发育基因，影响小孢子胚胎发生的成功与否。在小麦研究中，发现特定的表观遗传修饰能够影响花粉发育和生长素信号基因的表达，通过调节这些修饰，有望提高小麦育种中 DH 诱导的效率。同时，细胞死亡途径也参与小孢子胚胎发生的调控，在油菜小孢子培养中，发现半胱天冬酶（MCAs）和自噬会导致细胞死亡，抑制这些过程可减少细胞死亡，促进原胚形成，为提高作物育种中 DH 产量提供了新的思路。然而，小孢子培养效率不仅受胁迫条件和分子机制的影响，小孢子的发育阶段和培养基等因素也至关重要，精确控制培养条件，如温度、光照和营养成分，对于获得高效的胚胎发生至关重要。

小孢子培养在作物改良中的应用

双单倍体的生产

小孢子培养在植物育种中最重要的应用之一是生产双单倍体（DH）植株。DH 植株在所有遗传位点上完全纯合，携带相同的等位基因，这一特性对植物育种至关重要，有助于培育出均匀、稳定的品系，是开发高性能品种的基础。传统的纯合系培育方法，如多代自交，耗时费力，而小孢子培养能够在单代内产生纯合系，显著缩短育种周期。在大麦和小麦等作物中，传统方法需要多代才能实现纯合，而 DH 技术可将育种周期缩短数年，加快新纯合自交系的培育，为市场提供高产、抗病或抗逆的新品种。

在杂交品种培育方面，DH 系的遗传一致性是关键。例如，玉米和水稻等通过杂种优势培育的谷物，需要均匀的亲本才能获得最佳效果。DH 系的完全纯合性确保了杂种后代的遗传一致性，从而在产量、成熟度和品质上表现出稳定性。此外，DH 植株在基因定位，尤其是数量性状位点（QTL）定位和全基因组关联研究（GWAS）中发挥着重要作用。由于其完全纯合的特性，能够清晰、稳定地表现出性状，有助于识别控制重要农艺性状的基因或位点。

增强遗传多样性

除了加速育种进程，小孢子培养还有助于增加作物的遗传变异，促进作物改良。在体外培养过程中，可能会产生体细胞克隆变异，这是由于自发突变或染色体变化导致的。这些变异可能产生具有优良性状的新表型，如提高抗病性、增加产量或增强抗逆性。体细胞克隆变异在基因库有限的作物，如土豆和香蕉中尤为重要，为传统育种难以实现的遗传改良提供了可能。

此外，小孢子培养还可能导致多倍体的产生，即植物细胞中含有超过两组染色体。多倍体植物通常具有更强的活力、更大的器官和更高的环境胁迫耐受性。例如，在小麦中，多倍体化增强了作物的适应性和产量潜力。研究表明，通过小孢子培养诱导多倍体，在其他作物中也具有潜力，特别是对于那些多倍体植株可能更具活力或抗病性的物种。如在西兰花（Brassica oleracea）的研究中发现，小孢子培养诱导多倍体可提高生物量和对环境的高胁迫耐受性。这些遗传改良充分体现了小孢子培养在增强遗传多样性和提高作物性能方面的重要作用。

遗传资源的保护

小孢子培养技术在基因库建设中具有重要意义，尤其适用于濒危物种或具有重要经济价值的地方品种的保护。通过小孢子培养获得 DH 系，能够从有限的组织中保存这些珍贵的基因型，对于因栖息地破坏或遗传侵蚀而面临风险的珍稀或濒危植物物种的保护至关重要。育种者可通过生产 DH 系，有效保存这些植物的种质资源，并确保其在后续育种过程中的供应。

冷冻保存技术可将生物材料在超低温下长期保存，与小孢子培养相结合，能够更有效地保存遗传资源。小孢子培养获得的单倍体和 DH 系可进行冷冻保存，作为未来育种或恢复遗传多样性的有用资源。例如，水稻和烟草等作物已成功应用冷冻保存技术保存 DH 系，避免了持续培养带来的问题。此外，体外保存种质资源还为保存遗传变异性提供了新方法，对于那些种子难以萌发或传统繁殖技术难以应用的作物，小孢子培养衍生的体外培养保存技术具有重要意义，有助于保护植物遗传资源，并为后续的植物育种计划提供支持。

基因组编辑中的应用

小孢子培养与基因组编辑工具，如 CRISPR/Cas9 系统的结合，为作物改良带来了新机遇。通过小孢子培养获得的 DH 系统植株，由于其纯合性，所有引入的遗传变化都能在群体中固定，特别适合进行基因组编辑。这意味着能够直接将所需的优良性状，如抗病性、耐旱性或更好的营养成分等引入植株，而无需经过新的育种周期来固定这些性状。

CRISPR/Cas9 技术已在水稻和小麦等作物中应用，通过对特定基因组进行修饰，提高了作物的产量和抗逆性。将基因组编辑与小孢子培养相结合，能够在单代内将多个编辑性状引入 DH 系，加速培育具有多种优良性状的作物品种，如提高产量、增强抗病性和适应气候变化的能力。此外，利用小孢子培养进行基因组编辑，在堆叠多个性状时更加高效，由于 DH 植株的纯合性，更容易将多个编辑性状整合到一个品系中，使培育具有多种优良基因的新品种变得更加可行。例如，将抗病虫害、耐旱和营养利用效率等性状整合到一个作物品种中，通过小孢子培养作为基因组编辑的平台，能够显著提高精准育种的效率，应对气候变化和其他环境挑战，推动作物改良的发展。

小孢子培养已成功应用于多种作物的育种计划，包括谷物、蔬菜和观赏植物等。目前，研究人员正致力于将小孢子培养技术应用于更多难以培养的物种，如一些豆科植物和木本植物，通过克服诱导单倍体胚胎发生的难题，扩大其应用范围。同时，不断优化培养基、改进胁迫处理方法和筛选促进胚胎发生的生长调节剂，以提高培养效率，使小孢子培养成为一种更普遍适用的植物育种工具。

谷物小孢子培养的进展

研究人员广泛利用小孢子培养技术培育纯合谷物用于育种。相较于花药培养，小孢子衍生组织更易于建立悬浮体系，且操作相对简单。由于小孢子的单细胞结构，遗传转化更容易实现，能够快速获得转基因纯合植株。

在大麦（Hordeum vulgare）的研究中，通过温度休克处理和改良培养基，成功实现了小孢子培养，并获得了首个纯合 DH 系。冷预处理提高了花药培养的胚胎发生响应，优化后的培养方案使用二甲基亚砜（DMSO），不仅促进愈伤组织诱导和绿色植株再生，还降低了作物白化现象的发生。目前，小孢子培养技术在大麦育种中取得了显著成效，提高了对 powdery mildew 和 rust 等病害的抗性。

小麦小孢子培养如今也取得了进展，减少了生产 DH 系所需的世代数，避免了额外的自交步骤。早期研究证实了该技术能够培育出纯合植株系，DH 系在提高小麦抗病性和产量潜力方面发挥了重要作用。研究人员通过优化预处理方案、添加麦芽糖梯度和组蛋白去乙酰化酶抑制剂等方法，提高了胚胎发生效率和植株质量。

水稻小孢子培养在遗传作图和标记辅助选择中发挥着重要作用，有助于开发抗稻瘟病和氮效率相关的标记，加速 DH 系的培育，用于基因定位和育种改良。通过改进胁迫处理和优化培养基成分，提高了单倍体诱导效率。例如，糖饥饿预处理和低温预处理等方法，显著提高了水稻小孢子胚胎发生的效果。

玉米（Zea mays）小孢子培养诱导单倍体面临诸多挑战，但随着技术的发展，取得了一定进展。优化小孢子分离方法后，能够获得大量有活力的小孢子，并成功培育出 DH 植株。研究还发现，引入化学诱导剂和胁迫处理，可提高胚胎发生微孢子的形成和 DH 植株的产量，为玉米育种提供了新途径。然而，谷物小孢子培养仍面临一些问题，如基因型依赖性和白化现象，研究人员正致力于解决这些问题，结合基因工程和杂交策略，提高微孢子培养的效率，使其成为谷物遗传改良的重要工具。

芸薹属植物小孢子培养的进展

小孢子培养是芸薹属植物，如油菜（Brassica napus）、甘蓝（B. oleracea）和芥菜（B. juncea）等重要的植物生物技术方法。198