重大发现！基因编码脂质传感器揭示溶酶体中 PIP3的奥秘及其关键意义

本文利用基因编码的脂质传感器，发现 PIP3存在于溶酶体中，且通过内吞途径从质膜转运而来。这一发现有助于深入理解细胞生理学和癌症等疾病中 PI3K/Akt 信号通路的调控机制，为相关研究提供了重要依据。

　　### 研究背景
在细胞的众多生理过程中，磷脂酰肌醇（3,4,5）三磷酸（PIP₃）和磷脂酰肌醇（3,4）二磷酸（PI (3,4) P₂）作为重要的脂质第二信使，在磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）/ 蛋白激酶 B（Akt）信号通路里发挥着关键作用。这一信号通路对细胞的生长意义重大，并且在癌症等疾病中常常出现异常调节。

以往，人们普遍认为 PIP₃主要存在于质膜上，然而，越来越多的研究暗示这些脂质第二信使可能在其他膜区室中也有分布。但目前对于它们在除质膜外其他膜区室的空间调控机制，我们了解得还十分有限。

溶酶体曾经仅被看作是细胞内大分子的回收中心，如今已被证实它还是细胞营养感知和信号转导的关键枢纽。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物 1（mTORC1）作为氨基酸和营养物质的传感器，会被招募到溶酶体并在此激活，进而抑制自噬、促进蛋白质翻译，最终推动细胞的生长和存活。PI (3,4) P₂和 PIP₃作为 mTORC1 信号通路的上游重要成分，其在溶酶体营养感知方面的作用备受关注。此前研究虽发现这两种脂质会在溶酶体积累并调节相关信号，但并不清楚哪种脂质占主导，也不明确它们是在溶酶体本地产生还是从其他地方转运而来。要深入探究这些问题，就需要更精准的工具来分别探测它们在亚细胞层面的积累情况。

现有的脂质传感器种类多样，其中基于易位的传感器较为常见，它能结合 3 - 磷酸肌醇（3-PIs）并定位到脂质所在之处，但难以检测亚细胞中较小的脂质池，且其定位易受多种因素干扰。基于荧光共振能量转移（FRET）的翻转传感器虽可监测磷脂酰肌醇动态变化，但需要膜的连接才能发挥作用，在不同亚细胞区室的通用性欠佳。因此，开发新型的脂质传感器迫在眉睫。

研究方法

为了深入研究 PI (3,4) P₂和 PIP₃在细胞内的空间调控机制，研究人员设计并构建了两种基于 FRET 的基因编码脂质传感器 ——InPGrp 和 InPTapp。

InPGrp 用于特异性检测 PIP₃，它的分子开关包含能特异性结合 PIP₃的 GRP1-PH 结构域和一段假配体肽序列 VAEEEDDEEEDEDD。这一分子开关夹在青色荧光蛋白 Cerulean 和环形排列的黄色荧光蛋白 circularly permuted Venus（E172）之间。当 PIP₃不存在时，假配体与 GRP1 的一些碱性残基相互作用；一旦有 PIP₃出现，它会竞争掉假配体，使传感器发生构象变化，进而导致黄色与青色荧光发射比率增加。研究人员通过将 C 末端 Kras 靶向序列 CAAX 添加到 InPGrp 上，使其能够定位于质膜，从而检测质膜上 PIP₃的动态变化。

InPTapp 则用于特异性检测 PI (3,4) P₂，其设计原理与 InPGrp 类似，分子开关包含特异性结合 PI (3,4) P₂的 Tapp1-PH 结构域和与 InPGrp 相同的假配体肽序列，该分子开关夹在 Cerulean 和 Citrine 荧光蛋白之间。同样，通过在其 C 末端融合 CAAX 靶向序列，实现对质膜上 PI (3,4) P₂动态变化的检测。

此外，研究人员还对细胞进行处理，通过多种方式来探究脂质在细胞内的积累和转运机制。例如，用生长因子血小板衍生生长因子（PDGF）刺激血清饥饿的 NIH3T3 细胞，观察脂质传感器的响应；使用 PI3K 抑制剂 PIK-75 预处理细胞，探究 PI3K 活性对脂质积累的影响；利用脂质磷酸酶来选择性降解不同的磷脂酰肌醇，以此验证传感器对特定脂质的特异性；将传感器与溶酶体靶向基序 LAMP1 融合，研究脂质在溶酶体的积累情况；用内吞作用抑制剂 Dyngo-4a 预处理细胞，或表达显性负突变的 dynamin-2（DN-dynamin，K44A 突变），探究内吞作用在脂质积累中的作用等。

研究结果

1. InPGrp 和 InPTapp 的特异性及质膜检测功能：实验结果表明，InPGrp 能够特异性地检测质膜上 PIP₃的动态变化。用 PDGF 刺激血清饥饿的 NIH3T3 细胞后，InPGrp-Kras 的黄色 / 青色发射比率增加，证明 PIP₃在质膜积累。而构建的突变体 InPGrp-Kras（K273A），由于其 PH 结构域的突变导致无法结合 PIP₃，在 PDGF 刺激下无明显响应，这进一步证实了 InPGrp 对 PIP₃的响应特异性。同时，当用 PI3K 抑制剂 PIK-75 预处理细胞时，InPGrp-Kras 对 PDGF 的响应消失，表明通过 InPGrp 观察到的 PIP₃积累依赖于 PI3K 的活性。

在与其他类似脂质的特异性比较实验中，研究人员将 InPGrp-Kras 与不同的脂质磷酸酶共表达。结果显示，能将 PIP₃转化为其他脂质的 PTENA4 和 INPP5E，会使 InPGrp-Kras 对 PDGF 的响应减弱；而只作用于 PI (3,4) P₂的 INPP4B 则对 InPGrp-Kras 的响应无显著影响。这一系列实验充分证明了 InPGrp 对 PIP₃的特异性，使其成为一种可靠的 PIP₃水平检测工具。

InPTapp 同样能够特异性地检测质膜上 PI (3,4) P₂的动态变化。PDGF 刺激血清饥饿的 NIH3T3 细胞后，InPTapp-Kras 的黄色 / 青色发射比率增加，表明 PI (3,4) P₂在质膜积累。构建的突变体 InPTapp-Kras（R211L），因 Tapp1-PH 结构域突变无法结合 PI (3,4) P₂，在 PDGF 刺激下无明显响应。并且，用 PIK-75 预处理细胞后，InPTapp-Kras 对 PDGF 的响应也消失，这表明 PI (3,4) P₂的积累依赖于 PI3K 的活性。

在与其他脂质的特异性比较实验中，与能转化 PI (3,4) P₂的 PTENA4 和 INPP4B 共表达时，InPTapp-Kras 对 PDGF 的响应减弱；而与只转化 PIP₃的 INPP5E 或载体对照 mCherry-Kras 共表达时，InPTapp-Kras 的响应不受影响。这充分说明 InPTapp 对 PI (3,4) P₂具有特异性，可有效检测质膜上 PI (3,4) P₂的动态变化。
2. PIP₃和 PI (3,4) P₂在溶酶体的积累：研究人员将 InPGrp 和 InPTapp 与溶酶体靶向基序 LAMP1 融合，构建出 Lyso-InPGrp 和 Lyso-InPTapp，用于探测脂质在溶酶体的积累情况。结果发现，PDGF 刺激血清饥饿的 NIH3T3 细胞后，Lyso-InPGrp 的 Y/C 发射比率增加，表明 PIP₃在溶酶体积累；Lyso-InPTapp 也对 PDGF 刺激有一定响应，说明 PI (3,4) P₂同样在溶酶体积累。

进一步对积累参数进行分析，发现 InPTapp 响应的平均 t_1/2（达到最大响应一半所需的时间）在质膜和溶酶体都比 InPGrp 长，这与之前认为 PI (3,4) P₂可能由 PIP₃去磷酸化生成的观点相符。同时，InPGrp 在溶酶体的 t_1/2比在质膜长，这暗示质膜的 PIP₃可能是溶酶体 PIP₃积累的前体或必要条件。

在响应幅度方面，InPGrp 和 InPTapp 在质膜对 PDGF 的响应相当，但在溶酶体中 InPGrp 的响应幅度显著高于 InPTapp，这表明溶酶体中 PIP₃的积累量大于 PI (3,4) P₂。可持续活动指标 15（SAM15）显示，InPGrp 在质膜和溶酶体的 SAM15 值都高于 InPTapp，说明 PIP₃的动态变化比 PI (3,4) P₂更持久。综合这些数据，充分揭示了溶酶体中 PIP₃的优先积累现象。
3. 溶酶体脂质积累与内吞作用的关系：由于溶酶体脂质积累滞后于质膜脂质生成，研究人员推测可能存在从质膜到溶酶体的脂质转运机制，而内吞作用是蛋白质和脂质转运到溶酶体的常见途径。为验证这一推测，研究人员用内吞作用抑制剂 Dyngo-4a 预处理表达 Lyso-InPGrp 或 Lyso-InPTapp 的细胞，结果发现 PDGF 刺激下，Lyso-InPGrp 和 Lyso-InPTapp 的响应均消失，这表明溶酶体中 PIP₃和 PI (3,4) P₂的积累都依赖于 dynamin 依赖的内吞作用。

此外，研究人员还通过表达显性负突变的 dynamin-2（DN-dynamin，K44A 突变）来抑制 dynamin 介导的内吞作用，结果同样证实了溶酶体中 PIP₃和 PI (3,4) P₂的积累依赖于 dynamin 依赖的内吞作用。而 Dyngo-4a 预处理对质膜靶向的 InPGrp 和 InPTapp 的 PDGF 诱导响应无显著影响，进一步说明内吞作用主要影响的是脂质在溶酶体的积累，而非质膜。
4. PIP₃的来源及转运途径：溶酶体中 PIP₃积累依赖内吞作用，这可能有两种机制：一是关键信号成分（如受体或脂质激酶）被内化，导致 PIP₃在溶酶体积累；二是质膜生成的 PIP₃通过内吞作用内化并转运到溶酶体。

此前有研究认为内化的 PDGF 受体（PDGFR）是内膜 PIP₃积累的原因，为验证其对溶酶体 PIP₃积累的影响，研究人员将 PDGFR 磷酸酶蛋白酪氨酸磷酸酶 - 1B（PTP1B）靶向到内体。结果发现，虽然 PTP1B 抑制了内质网依赖内化 PDGFR 的 PIP₃积累，但对溶酶体中 InPGrp 对 PDGF 的响应并无影响，这表明溶酶体中 PIP₃的积累并不依赖于内化的 PDGFR。

为验证第二种机制，研究人员利用质膜靶向的磷酸酶来消耗质膜的 PIP₃，同时用 InPGrp 观察溶酶体 PIP₃的动态变化。结果发现，过表达能将 PIP₃转化为其他脂质的质膜靶向 PTENA4 和 INPP5E，会抑制 PDGF 刺激后溶酶体 PIP₃的积累；而过表达 INPP4B-Kras 或载体对照 mCherry-Kras 则无此影响。这充分说明质膜的 PIP₃是溶酶体 PIP₃的来源。

研究人员还对 PIP₃的转运途径进行了探究。利用荧光染料 ECGreen 监测内吞作用，发现添加 PDGF 和 ECGreen 后 1 - 2 分钟内，内吞小泡迅速出现，并与溶酶体接近或共定位。同时，研究人员构建了内体靶向的 InPGrp（Endo-InPGrp）和 InPAkt，检测到 PDGF 刺激后，内体有 PIP₃积累，且其积累可被 PI3K 抑制剂 PIK75 抑制。此外，内体靶向的 INPP5E 可抑制溶酶体 Lyso-InPGrp 和 Lyso-InPAkt 对 PDGF 的响应。综合这些结果表明，PIP₃从质膜通过内吞作用转运到内体，再从内体转运到溶酶体。

研究讨论

1. 脂质传感器的优势与应用前景：本研究开发的 InPTapp 和 InPGrp 这两种基因编码的 FRET - 基于的脂质传感器，具有显著优势。与基于易位的传感器相比，它们能够特异性地靶向特定的亚细胞位置，从而实现对脂质在不同亚细胞区室动态变化的精准监测。与翻转传感器相比，InPTapp 和 InPGrp 的靶向性更强，且具有调节亲和力的潜力。其独特的假配体设计，使传感器的响应不受膜连接的限制，在不同亚细胞环境中都能灵活发挥作用。这种基于假配体的设计策略已成功应用于多种生物传感器的开发，未来有望进一步优化这些传感器的动态范围，为研究其他脂质或小分子 GTP 酶活性提供有力工具。
2. PIP₃和 PI (3,4) P₂的差异及意义：尽管 PIP₃和 PI (3,4) P₂在细胞脂质含量中占比不足 1%，但它们对细胞功能有着重要影响。在营养或有丝分裂刺激下，它们会招募多种效应蛋白，激活重要的信号通路。本研究发现，这两种脂质在溶酶体膜上的行为模式存在明显差异。PIP₃在溶酶体中的积累水平更高、速度更快且更持久，而 PI (3,4) P₂积累较慢且可持续性较差。PI (3,4) P₂积累缓慢可能与其产生的顺序有关，而其可持续性差可能是由于内体中的 INPP4B 将其转化为 PI3P，从而抑制了 PI (3,4) P₂在溶酶体的持续积累。
3. PIP₃在细胞内的转运机制及意义：PIP₃作为 PI3K 的直接脂质产物，对细胞信号转导至关重要。本研究深入探究了 PIP₃在细胞内的转运机制，发现 PDGF 刺激后，质膜产生的 PIP₃通过 dynamin 介导的内吞作用进入内体，再转运到溶酶体。这一过程可能受到多种因素的影响，如溶酶体重分布到细胞周边，使溶酶体更接近 PIP₃的来源，从而促进了 PIP₃的转运。未来研究还需进一步确定内溶酶体成熟、囊泡介导的脂质转移或溶酶体重新定位促进的膜接触位点等过程是否参与 PIP₃向溶酶体的转运。
4. 溶酶体 PIP₃的功能及研究展望：溶酶体 PIP₃在细胞内具有多种重要功能，它可以促进 Akt 和 mTORC1 的局部激活，对下游信号通路的精细调节至关重要。此外，PIP₃转运到溶酶体可能参与溶酶体动力学、溶酶体与脂滴的相互作用以及溶酶体修复等过程。同时，涉及溶酶体的细胞器接触位点是脂质转移的重要场所，溶酶体 PIP₃可能利用这一过程进一步在细胞内转运脂质。近年来，对线粒体 - 溶酶体接触的研究以及线粒体 PIP₃结合蛋白 FUNDC2 的发现，