中枢 TYK2 抑制：揭示 TYK2 作为关键神经免疫调节因子及多发性硬化潜在治疗靶点

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Central TYK2 inhibition identifies TYK2 as a key neuroimmune modulator

本文聚焦酪氨酸激酶 2（TYK2），利用中枢可渗透的 TYK2 抑制剂（cTYK2i）与外周限制的抑制剂（pTYK2i），在多种神经炎症模型中探究其作用。结果表明，cTYK2i 能减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）症状，调节免疫细胞和细胞因子，为多发性硬化（MS）治疗提供新策略。

　　### 研究背景
酪氨酸激酶 2（TYK2）属于 Janus 激酶（JAKs）家族，在介导细胞内信号传导以及细胞对生长因子和细胞因子的反应中发挥着关键作用。它参与调节多种炎症通路，其功能异常与多种炎症性疾病相关，如银屑病、系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎和多发性硬化（MS）等。全基因组关联研究（GWAS）发现，TYK2 的一个保护性亚型等位基因（P1104A）与 MS 有关，携带该等位基因会降低 TYK2 活性，通过削弱 I 型干扰素（IFN）和 IL-12/23 信号传导，对多种炎症性疾病起到保护作用。然而，尽管 TYK2 在中枢神经系统（CNS）的所有细胞类型中均有表达，但人们对其在 CNS 中的具体作用了解甚少。此前的研究模型无法区分外周和中枢 TYK2 信号传导对 EAE 发病机制的影响，且外周限制的 TYK2 抑制剂（BMS-986165）对 EAE 的作用也未被研究。因此，本研究旨在利用选择性且能穿透血脑屏障的 TYK2 抑制剂（cTYK2i），深入探究 TYK2 在 CNS 中的功能及作用机制。

实验设计

1. 实验动物：选用 8 - 10 周龄的 C57BL/6NCRL 小鼠、14 - 15 周龄的 LEW/Crl 大鼠以及成年雌性 C57BL/6 J 小鼠。所有动物实验程序均获得相关机构动物伦理委员会的批准。
2. 实验化合物：研究使用了化合物 A（Cmpd-A）、化合物 B（Cmpd-B）和 BMS-986165。其中，Cmpd-A 和 Cmpd-B 由 Neuron23 研发，BMS-986165 根据文献方法合成。
3. 实验模型
   • IFNγ PK/PD 模型：给 6 - 9 周龄的 C57BL/6NCRL 小鼠口服测试化合物，0.5 小时后腹腔注射重组 IFNγ，3 小时后收集组织样本，用于评估化合物对 IFNγ 刺激的信号通路的影响。
   • EAE 诱导模型：小鼠通过皮下注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）_{35 - 55}/ 完全弗氏佐剂（CFA）、MOG_{1 - 125}/CFA 或 CFA（对照组），并在第 0 天和第 2 天腹腔注射百日咳毒素诱导 EAE；大鼠则皮下注射豚鼠髓鞘碱性蛋白（gpMBP）_{69 - 88}/CFA 或 CFA 诱导 EAE。通过特定的评分标准量化神经肌肉缺陷的临床表现。
   • PPMS 重组抗体（rAb）小鼠模型：从 PPMS 患者脑脊液中提取 B 淋巴细胞，对其进行测序并制备重组抗体（rAb）。将 rAb 注入成年雌性 C57BL/6 J 小鼠体内诱导疾病，评估 cTYK2i 对该模型的治疗效果。
   
   
4. 实验分组与处理：实验分为半治疗范式、治疗范式和预防范式。半治疗范式在 20% 的 MOG 诱导动物临床评分达到 0.5 时开始治疗；治疗范式在动物临床评分至少达到 0.5 时单独纳入给药组；预防范式在注射 PPMS rAb 前一天开始治疗。根据实验设计，对不同组别的动物给予相应的化合物处理。

实验结果

1. TYK2 抑制剂对 iPSC 衍生细胞信号传导的影响：在体外实验中，通过测量磷酸化信号转导和转录激活因子（pSTAT）水平，评估 TYK2 抑制剂的效力和选择性。结果显示，Cmpd-A、Cmpd-B 和 BMS-986165 对 IFNγ 刺激的 THP-1 细胞中 pSTAT5 的 IC₅₀分别为 6.4 nM、2.9 nM 和 1.2 nM。在人诱导多能干细胞（iPSC）衍生的星形胶质细胞（iAstrocytes）和小胶质细胞（iMicroglia）中，Cmpd-A 能有效抑制 TYK2 信号传导，其对 iAstrocytes 中 TYK2 的 IC₅₀为 5.1 nM，对 pSTAT5 和 pSTAT3 的 IC₅₀分别为 6.4 nM 和 8.0 nM；在 iMicroglia 中，Cmpd-A 抑制 IFNγ 诱导的 pSTAT5 的 IC₅₀为 2.9 nM。这表明 TYK2 信号在星形胶质细胞和小胶质细胞中能被 IFNγ 强烈诱导，并可被 Cmpd-A 有效抑制。
2. 对中枢神经系统 I 型 IFN 通路活性的影响：利用急性 IFN 挑战小鼠模型，研究发现 BMS-986165、Cmpd-A 和 Cmpd-B 在脾脏和血浆中均能剂量依赖性地降低干扰素刺激基因（ISGs）和 C-X-C 基序趋化因子 10（CXCL10）的水平。然而，只有 cTYK2i（Cmpd-A 和 Cmpd-B）能够降低大脑中 I 型 IFN 通路的活性，其在大脑中的 IC₅₀分别为 5.4 nM 和 3.5 nM。这表明只有中枢可渗透的 TYK2 抑制剂才能有效降低中枢神经系统中 I 型 IFN 通路的活性。
3. 对 MOG_{35 - 55} EAE 小鼠模型临床评分的影响：在 MOG_{35 - 55} EAE 小鼠模型中，给予 Cmpd-A 和 BMS-986165 进行半治疗范式实验。结果显示，Cmpd-A 能显著且剂量依赖性地降低临床评分，例如，IC₇₅靶向剂量（150 mg/kg/ 天）可使临床评分总体降低 84%，而 BMS-986165 对临床评分的降低作用不显著。同时，Cmpd-A 还能减少中枢神经系统（CNS）中浸润的 CD3⁺/CD4⁺ T 细胞数量，降低 EAE 大脑中的 ISG 评分，且 T 细胞浸润的减少与干扰素信号的降低密切相关。这表明中枢 TYK2 抑制对改善 MOG_{35 - 55} EAE 小鼠模型的临床症状至关重要。
4. 对 MOG_{1 - 125} EAE 小鼠模型的影响：在 MOG_{1 - 125} EAE 小鼠模型中，进行暴露匹配的全治疗给药方案。cTYK2i（Cmpd-B）在出现临床症状后开始治疗，能够显著逆转临床评分，效果优于 pTYK2i（BMS-986165）。Cmpd-B 治疗还能使动物在开放场实验中的运动距离恢复正常。在细胞浸润方面，高剂量的 Cmpd-B（60 mg/kg/ 天）能显著减少 CNS 中 CD3⁺/CD4⁺ T 细胞数量和 Th17 细胞比例，所有治疗组的 B 细胞数量均减少约 40%，但血浆中针对 MOG_{1 - 125}抗原的 IgG 水平不受治疗影响。这表明 cTYK2i 在 MOG_{1 - 125} EAE 小鼠模型中具有显著的治疗效果，且其作用主要通过影响 T 细胞生物学实现。
5. 对 EAE 中小胶质细胞激活的影响：通过对 MOG 免疫小鼠的脊髓进行免疫组织化学（IHC）分析，发现 Cmpd-B 能显著减少 Iba1⁺小胶质细胞的数量，降低脊髓中脱髓鞘区域的面积，而对反应性星形胶质细胞群体（基于 GFAP⁺像素面积）没有明显影响。这表明中枢 TYK2 抑制可能通过减少小胶质细胞的增殖，进而降低神经炎症。
6. 对神经炎症相关信号通路和生物标志物的影响：对 MOG_{35 - 55}和 MOG_{1 - 125} EAE 小鼠的全脑样本进行靶向基因表达分析，发现 cTYK2i 能够显著挽救许多因 MOG 诱导而失调的基因，这些基因涉及 Toll 样受体（TLR）、干扰素调节因子（IRF）、核因子 κB（NF-κB）、干扰素诱导的抗病毒反应以及细胞因子受体等多个家族。在神经炎症生物标志物方面，cTYK2i（Cmpd-A 或 Cmpd-B）能降低脊髓组织中多种促炎细胞因子（如 IL-6、IL-1β）和趋化因子（如 CXCL10、IL-16、CCL3、CCL4、CXCL13）的水平，且部分分析物（如 IL-2、CXCL10、IL-16、CCL3、CCL4、CXCL13）仅对 cTYK2i 有反应。此外，Cmpd-B 还能显著降低 IL-12/IL-23p40 和 IL-17A 的水平，且神经炎症分析物与 CNS 中的 CD4⁺ T 细胞的相关性比与 B 细胞更强。这表明 cTYK2i 通过抑制 NF-κB 和 IFN 通路，有效减轻了神经炎症。
7. 对 PPMS rAb 小鼠模型的保护作用：在由 PPMS 患者脑脊液中致病性重组抗体（rAb）驱动的 MS 小鼠模型中，预防性给予 Cmpd-B（60 mg/kg/ 天）能显著改善运动缺陷评分和握力。同时，Cmpd-B 能减少脊髓中 Iba1⁺小胶质细胞的数量，降低 SMI-32 信号，表明其对神经元损伤或变性有抑制作用。该模型中，cTYK2i 的保护作用不依赖于抗原呈递成分或特异性 T 细胞 - 小胶质细胞相互作用，提示其在治疗 PPMS 方面具有潜在价值。
8. 对神经丝轻链（NfL）水平的影响：在 EAE 大鼠模型中，Cmpd-A 治疗能显著降低血浆（pNfL）和脑脊液（cNfL）中的 NfL 水平，且 cNfL 与临床严重程度以及 pNfL 之间存在显著相关性。在 MOG_{1 - 125} EAE 模型中，Cmpd-B 也能降低 pNfL 水平。这表明抑制中枢 TYK2 活性可以减轻神经炎症，对脱髓鞘疾病具有神经保护作用。
9. 对干扰素反应性反应性星形胶质细胞（IRRA）功能的影响：用肿瘤坏死因子 α（TNF-α）、IL-1α 和 C1q（TIC）或 TIC 联合 IFNγ 处理 iAstrocytes，诱导产生 A1 样和 IRRA 样表型。抑制 TYK2 活性能剂量依赖性地抑制 IRRA 样细胞的肥大表型，降低其基因表达评分（综合评分、干扰素评分和反应评分），并减少多种趋化因子（如 CCL3、CCL4、CXCL10、IL-6）和神经炎症标志物 YKL-40 的分泌。而对于 A1 样细胞，TYK2i 仅选择性地抑制 CXCL10 的分泌。这表明 TYK2 在调节 IRRA 样细胞的反应性和免疫反应功能中起关键作用。

研究结论

本研究通过一系列实验，明确了 TYK2 在调节神经炎症中的重要作用机制。中枢抑制 TYK2 对于调节 EAE 的病理生理过程至关重要，I 型 IFN 诱导的 TYK2 信号通路在胶质细胞中功能完整，选择性抑制该通路可以产生多效性影响，从根源上消除神经炎症程序。cTYK2i 在多种 EAE 模型和 PPMS rAb 小鼠模型中均展现出显著的治疗效果，能够减轻神经炎症、改善临床症状、减少神经元损伤。此外，TYK2 还参与调节 IRRA 的功能，为治疗与星形胶质细胞反应性相关的神经退行性疾病提供了新的潜在靶点。这些研究结果为靶向中枢 TYK2 治疗 MS 提供了坚实的理论基础和实验依据，有望为 MS 的治疗开辟新的途径。未来，进一步研究 TYK2 在不同细胞类型和疾病阶段的具体作用机制，以及开发更具特异性和安全性的 TYK2 抑制剂，将有助于推动 MS 治疗领域的发展。