综述：循环肿瘤 DNA 监测实体瘤治疗反应并推进精准肿瘤学

《npj Precision Oncology》：Circulating tumor DNA to monitor treatment response in solid tumors and advance precision oncology

这篇综述聚焦循环肿瘤 DNA（ctDNA），阐述其在监测实体瘤治疗反应中的应用、挑战与未来方向。

　　

背景

在过去二十年，精准肿瘤学的出现显著改变了癌症治疗格局。精准肿瘤学强调在合适的时间为患者匹配恰当的分子疗法，以改善临床结果并减少无效和潜在有毒治疗的使用。然而，监测治疗反应的方法发展相对滞后，目前仍严重依赖成像技术和生物标志物，这些方法往往缺乏特异性，无法提供关键的分子信息，难以满足靶向治疗时代临床决策的需求。

肿瘤学面临的一个关键挑战是对患者进行动态分层以选择合适的治疗方案。实时分层对于确保治疗干预的及时性和有效性至关重要。传统的组织活检虽然有一定信息价值，但由于其侵入性，通常无法重复使用，且难以全面捕捉肿瘤的异质性和扩散情况，尤其是在转移性肿瘤中。

成像技术，如依据实体瘤疗效评价标准（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST）的方法，仍是监测治疗反应的金标准。RECIST 是一套标准化标准，用于评估肿瘤对治疗的反应，在临床实践和临床试验中广泛应用，也得到了监管机构的认可。不过，其主要关注肿瘤大小的宏观解剖变化，这并不总是与靶向治疗和免疫治疗的关键分子或细胞变化相关，且无法检测微小残留病（Minimal Residual Disease，MRD）等微观疾病，还存在检测早期治疗反应敏感性不足的问题。

液体活检作为一种新兴的癌症监测方式，通过分析血液、尿液或唾液等生物流体中的循环生物标志物发挥作用。与传统组织活检相比，液体活检具有微创、可实时分析癌症负担、疾病进展和治疗反应等优势，操作简便、成本较低，有望融入常规临床实践，为个性化治疗提供动态平台。液体活检可研究的分析物包括循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）、细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）和循环肿瘤 DNA（Circulating Tumor DNA，ctDNA）等。其中，ctDNA 作为一种极具临床潜力的生物标志物，是本文的重点研究对象。

血液中含有主要源于造血细胞和其他正常细胞生理性凋亡的游离 DNA（cell-free DNA，cfDNA），检测 ctDNA 需要识别其肿瘤特异性特征，如体细胞突变、甲基化谱或病毒序列等，以区分于非肿瘤来源的 cfDNA。血液中 ctDNA 的含量与肿瘤负担和细胞周转相关，在早期癌症中，ctDNA 占总 cfDNA 的比例通常低于 1%，而在晚期疾病中可高达 90%。cfDNA 在循环中的半衰期估计在 16 分钟至数小时之间，这使得实时监测肿瘤异质性和亚克隆变化成为可能。此外，cfDNA 释放与细胞死亡有关，其携带的突变信息涵盖原发性肿瘤和转移部位，可反映全身疾病情况，且其片段化模式也有助于区分 ctDNA 与正常 cfDNA。

尽管 ctDNA 在癌症诊断和预后方面有研究，但目前其最直接的临床应用是评估治疗反应和 MRD。ctDNA 能够以一种简单、特异性且无创的方式检测极低水平的疾病，有助于评估治疗反应、残留疾病的存在以及耐药性的出现。不过，ctDNA 在临床应用中面临一些挑战，如含量低和技术标准化不足等问题，需要改进检测方法、建立标准化协议并开展大规模临床试验来验证其在不同癌症人群中的临床效用。本文旨在全面综述 ctDNA 研究的现状，包括用于分析的新方法和生物流体，重点探讨其在常见实体瘤治疗反应评估中的应用，同时介绍临床应用、正在进行的试验和新兴研究，分析其临床应用面临的挑战并讨论未来发展方向。

检测 ctDNA 的方法：进展与挑战

由于 ctDNA 在血液中的含量相较于非癌症（正常）cfDNA 较低，因此需要高灵敏度的技术来有效检测循环中的肿瘤特异性 DNA。目前已应用和开发了多种检测和分析 ctDNA 的方法，主要集中在识别肿瘤特异性体细胞突变或其他基因组改变。驱动突变常被用作疾病负担的指标，通过检测 ctDNA 中此类突变的水平，可以纵向追踪疾病负担、MRD 和治疗反应。评估分子反应通常涉及评估治疗后 ctDNA 的清除情况、与基线相比的百分比变化等定量指标，此外，获得性耐药突变等新兴改变也是评估治疗反应和选择 / 调整治疗方法的重要生物标志物。

靶向方法，如聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），能够高灵敏度且快速地检测突变。定量 PCR（quantitative PCR，qPCR）、数字 PCR（digital PCR，dPCR）和 BEAMing（beads, emulsion, amplification, and magnetics）等技术常被应用。这些方法在肿瘤信息已知的分析中特别有用，即通过对原发性肿瘤组织进行测序确定感兴趣的突变或体细胞改变，然后用这些检测方法进行靶向检测。另外，特定癌症中常见的突变基因，如黑色素瘤中的 BRAF、肺癌和结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）中的 KRAS、乳腺癌中的 ESR1 和 PIK3CA、前列腺癌中的雄激素受体（Androgen Receptor，AR）、胶质瘤中的 IDH 以及葡萄膜黑色素瘤中的 GNAQ/11 等，即使在没有肿瘤组织分析的情况下也可作为检测靶点。然而，这些靶向方法每次检测可监测的突变或改变数量有限。

近年来，下一代测序（Next-Generation Sequencing，NGS）技术取得了显著进展，无需肿瘤信息即可在患者样本中检测更广泛的基因组改变。NGS 技术包括全外显子测序（Whole-Exome Sequencing，WES）、全基因组测序（Whole-Genome Sequencing，WGS）以及标记扩增子深度测序（tagged-amplicon deep sequencing，TAm-Seq）、安全测序系统（SafeSequencing System，Safe-SeqS）、癌症个性化深度测序（CAncer Personalized Profiling by deep Sequencing，CAPP-Seq）和靶向错误校正测序（targeted error correction sequencing，TECSeq）等靶向方法，能够全面评估患者特异性的基因组变化，为了解疾病提供更详细的信息，尤其适用于基因组高度不稳定的异质性癌症。但 NGS 存在一些问题，其大多数工作流程中的 PCR 步骤会引入低频错误，可能被误判为 ctDNA 中的低频变异。为此，许多方法采用独特分子标识符（Unique Molecular Identifiers，UMIs），即在 PCR 扩增前给 DNA 片段加上分子条形码，以帮助区分真正的突变和测序假象。2012 年，Schmitt 等人推出了双链测序技术，成为高精度测序的金标准，该技术对 DNA 双链的每条链进行标记和测序，进一步提高了 UMIs 的错误校正能力。此后，又有多种方法被开发以解决双链测序效率低的问题，如 SaferSeqS、NanoSeq 和 Singleton Correction 等。2023 年，Bae 等人开发了用于错误校正的串联原始双链技术（Concatenating Original Duplex for Error Correction，CODEC），其准确性比 NGS 高 1000 倍，且所需读数比双链测序少 100 倍。尽管 NGS 方法不断发展，但早期癌症和低脱落肿瘤中 ctDNA 输入量低的问题仍然存在。2024 年，Martin-Alonso 等人提出使用引物剂暂时降低体内 cfDNA 的清除率，为 ctDNA 领域提供了新的研究方向。此外，克隆性造血潜能不确定（clonal hematopoiesis of indeterminate potential，CHIP）变异的存在可能导致测序时出现假阳性，测序方法还面临成本高和分析时间长的挑战，限制了其在实时决策中的应用，而且低输入量的 cfDNA 需要在分析的广度和深度之间进行权衡，以检测低拷贝数的改变。

除了突变分析，基于非突变的方法也在探索用于 ctDNA 监测。例如，对于由病毒引起的癌症，如人乳头瘤病毒（human papillomaviruses，HPV）相关的口咽癌和宫颈癌、乙肝病毒（hepatitis B virus）相关的肝细胞癌以及疱疹病毒相关的某些淋巴瘤、鼻咽癌和卡波西肉瘤等，可以检测病毒 cfDNA。此外，DNA 甲基化或片段组分析也可用于 ctDNA 分析，这些方法有助于克服传统基因组 ctDNA 研究中存在的问题，如 CHIP 变异带来的干扰数据。

DNA 甲基化分析在许多方面可提供与其他基因分析类似的信息。与突变分析相似，启动子高甲基化可用于特定部位的纵向疾病监测，通常需要从肿瘤组织获取信息，常使用芯片进行检测。传统的 DNA 甲基化分析依赖亚硫酸氢盐转化，相关分析方法包括全基因组亚硫酸氢盐测序（Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS）和靶向亚硫酸氢盐测序等，这些方法在血浆和尿液中对癌症患者的纵向监测中已被证明有效。单个基因的高甲基化，如肝细胞癌中的 p16、结直肠癌中的 septin 9 和胶质瘤中的 MGMT 等肿瘤抑制基因，也是液体活检中检测癌症的有效工具。近年来，为减少亚硫酸氢盐转化导致的 DNA 降解问题，无亚硫酸氢盐的方法逐渐被应用。此外，染色质免疫沉淀测序（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing，ChIP-Seq）和甲基化 DNA 免疫沉淀测序（methylated DNA immunoprecipitation sequencing，MeDIP-Seq）等基于免疫沉淀的方法在 cfDNA 分析中越来越受欢迎，尤其在确定 cfDNA 的细胞来源方面有重要应用。

cfDNA 片段组学是液体活检领域的新兴研究方向，主要研究 cfDNA 的片段化模式、片段大小和末端特征。研究表明，癌症患者的 cfDNA 片段化模式更为多样，平均片段大小更小，这可用于区分癌症来源和非癌症来源的 cfDNA。例如，Diehl 等人使用 qPCR 首次发现含有突变序列的 cfDNA 片段通常比非突变 cfDNA 片段短。此外，研究团队利用自动电泳系统发现，HPV 阳性头颈部癌患者治疗后血浆中 cfDNA 片段大小显著增加，这可能是监测治疗反应的潜在生物标志物。近年来，新的生物信息学方法不断涌现，能够获取更大规模、高通量且更详细的片段组学数据，如 DELFI（DNA evaluation of fragments for early interception）、OCF（orientation-aware cfDNA fragmentation）、EPICseq（epigenetic expression inference from cfDNA-sequencing）、MDS（motif diversity score）、WPS（windowed protection score）、TFBS（assessing transcription factor-binding site accessibility）、LIQUORICE 和 Griffin 等方法。

目前，在液体活检领域，结合多种分析类型的多模态方法越来越普遍。研究通常会综合分析 cfDNA 样本中的拷贝数改变（Copy Number Alterations，CNA）、基因组、表观基因组和片段组等信息。例如，Parikh 等人的研究表明，整合表观基因组特征可使癌症复发的检测灵敏度比仅检测基因组改变提高 25 - 36%。此外，用于 ctDNA 分析的生物流体范围也不断扩大，除血浆外，还包括尿液、唾液、脑脊液（Cerebrospinal Fluid，CSF）等，用于监测治疗反应和疾病进展。

虽然目前大多数 ctDNA 研究以观察性为主，但 ctDNA 监测在指导临床决策方面的潜在作用不容忽视。近年来，多项临床试验已开展，旨在评估 ctDNA 监测在临床环境中的应用，如探索 ctDNA 在帮助临床医生选择初始治疗方案或根据 ctDNA 反应调整治疗方案方面的潜力。接下来的部分将重点介绍 ctDNA 在常见实体瘤中监测治疗反应、MRD 和耐药性的应用，并突出当前使用 ctDNA 的临床试验。

肺癌

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，在液体活检领域受到广泛研究。2016 年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了首个用于非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）的诊断性液体活检检测，这是液体活检应用的一个重要里程碑。Cobas EGFR Mutation Test v2（罗氏分子系统公司）是一种实时 PCR 检测方法，可检测 EGFR 基因 18、19、20 和 21 外显子中的 42 种突变，当无法获取活检肿瘤组织时，可用于临床为 NSCLC 患者开具 EGFR 抑制剂的处方。此后，FDA 又批准了另外两种基于液体活检的检测方法，即 Guardant 360 CDx 和 FoundationOne Liquid CDx 检测，它们均为基于 NGS 的检测面板，用于 NSCLC 患者的治疗选择。目前，越来越多的研究聚焦于对肺癌患者 ctDNA 的动态监测，以评估治疗反应。虽然大多数研究集中在 NSCLC（占肺癌病例的 85%），但近年来也有对小细胞肺癌（Small Cell Lung Cancer，SCLC）患者 ctDNA 监测的探索。

早期评估 NSCLC 中 ctDNA 的研究主要使用基于 PCR 的方法检测 cfDNA 中的特定点突变，如 KRAS 或 EGFR 基因。随着 NGS 技术的发展，基于测序的 ctDNA 分析方法在 NSCLC 中得到广泛应用。2014 年，Newman 等人引入了 CAPP-Seq 技术，并证明了其在检测 NSCLC 患者 ctDNA 中的有效性。在他们的研究中，II - IV 期 NSCLC 患者（n = 9）中 ctDNA 的检测率为 100%，I 期患者（n = 4）中为 50%，且 ctDNA 水平与肿瘤体积显著相关。随后，Chaudhuri 等人使用该方法对局部疾病（I - III 期）接受根治性治疗的肺癌患者进行 ctDNA 的纵向监测，发现其有助于检测治疗后的 MRD。2020 年，Moding 等人使用 CAPP-Seq 分析了 65 例局部晚期 NSCLC 患者的 218 份样本，发现巩固免疫检查点抑制治疗早期的 ctDNA 动态变化可用于识别对治疗有反应的患者。在 TRACERx（TRAcking non-small-cell lung Cancer Evolution Through Therapy (Rx)）研究的 100 例 I - III 期 NSCLC 患者队列中，通过系统发育 ctDNA 分析追踪了亚克隆突变和转移的发展。此外，许多研究强调了通过手术前后样本中 ctDNA 动态变化评估 NSCLC 预后和临床效用的价值，还有研究突出了 ctDNA 在检测 NSCLC 术后 MRD 方面的作用。

随着免疫疗法和靶向疗法的出现，NSCLC 的治疗格局发生了重大变化，尤其是对于晚期和转移性疾病患者。对个性化 NSCLC 治疗过程中 ctDNA 的纵向监测变得越来越重要，有助于检测获得性耐药突变并预测患者对治疗的反应。例如，多项研究使用 NGS 和 / 或 dPCR 监测 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine Kinase Inhibitors，TKIs）如阿法替尼或奥希替尼治疗期间的 ctDNA。研究发现，血浆 ctDNA 对治疗的反应在治疗后早期即可出现，这表明最佳的 ctDNA 评估时间可能在治疗的第一个周期内（早于标准成像时间点）。此外，纵向 ctDNA 监测在检测对靶向疗法产生获得性耐药的突变方面特别有用，如 EGFR-TKI 治疗期间的 EGFR T790M 耐药突变，以及对 ALK TKIs 和 BRAF 抑制剂的反应监测。这为在疾病进展前监测 ctDNA 中的耐药突变提供了潜在方法。近年来，多项研究探索通过 ctDNA 进行纵向疾病监测，以预测患者对治疗的反应，实现更早的临床决策和治疗干预。例如，欧洲癌症研究与治疗组织（European Organisation for Research and Treatment of Cancer，EORTC）肺癌小组 1613 APPLE 二期临床试验旨在评估通过 Cobas EGFR test v2 纵向监测血浆 EGFR T790M 状态在确定吉非替尼和奥希替尼最佳治疗方案方面的可行性。研究发现，连续监测 ctDNA 可在 RECIST 标准判断疾病进展前识别分子进展，使 17% 的患者能够更早地从吉非替尼转换为奥希替尼治疗，从而获得满意的无进展生存期（Progression-Free Survival，PFS）和总生存期（Overall Survival，OS）。表 1 总结了已完成并发表结果的评估 ctDNA 在肺癌中临床干预应用的临床试验，目前还有许多正在进行的临床试验评估 ctDNA 的干预作用。例如，BR.36 研究的第一阶段近期已发表，这是一项针对初治 NSCLC 患者的 ctDNA 分子反应适应性免疫化疗的二期临床试验，该试验的观察阶段表明，ctDNA 分子反应可识别出转移性 NSCLC 患者中不太可能从单药 PD-1 治疗中获得良好临床结果的患者。在 BR.36 试验的第二阶段，根据 ctDNA 分析确定有疾病进展风险的患者将被随机分配到强化治疗组或继续治疗组。此外，还有多项正在进行的临床试验，如 ADAPT-E、ADAPT-C 和 ctDNA Lung RCT 试验，旨在确定对初始治疗或手术后检测到 ctDNA（MRD）的 NSCLC 患者提供额外治疗是否有益。

与 NSCLC 相比，SCLC 是一种侵袭性疾病，占肺癌病例的 15%，但针对 SCLC 患者 ctDNA 监测的研究相对较少。SCLC 的特征是 TP53 基因几乎普遍失活，早期 ctDNA 研究使用基于 PCR 的方法检测 SCLC 患者 cfDNA 中的 TP53 突变。随后的研究采用 NGS 对 SCLC 患者进行纵向 ctDNA 分析，并证明了其监测疾病的能力。例如，Lovly 团队使用包含 14 个 SCLC 常见突变基因的靶向测序面板，证明了 ctDNA 分析在传统成像检测前发现疾病复发迹象以及作为治疗后预后指标的潜力。Nong 等人对 22 例 SCLC 患者治疗前后的血浆样本进行 430 个基因的靶向深度测序，发现治疗后 DNA 修复和 NOTCH 信号通路的突变富集，这表明 NGS 可用于分析 SCLC 的基因组进化。最近，有研究使用 WGS 检测 CNA，并结合 110 个 SCLC 相关基因的靶向测序分析 69 例 SCLC 患者的 cfDNA，其中 6 例患者有纵向样本。Sivapalan 等人对 33 例接受化疗或免疫治疗方案的转移性 SCLC 患者的连续血浆 ctDNA 和匹配的白细胞 DNA 进行靶向错误校正测序和染色体臂水平结构改变分析。这些研究都突出了使用新方法结合 ctDNA 动态监测评估 SCLC 患者对治疗分子反应的潜力。

结直肠癌

结直肠癌（CRC）是全球常见癌症之一，癌细胞向血液中释放 ctDNA 的水平较高，使得液体活检成为评估该疾病治疗反应<