非病毒 piggyBac 转座子系统构建转基因非人灵长类动物：开启生物医学研究新篇

《Nature Communications》：Non-viral generation of transgenic non-human primates via the piggyBac transposon system

为解决慢病毒法生成转基因猴的技术难题，研究人员用 piggyBac 转座子系统开展相关研究，成功生成转基因猴，意义重大。

　　

转基因非人灵长类动物研究：突破困境，开辟新径

在生物医学研究的广阔领域中，实验动物模型的遗传工程发挥着关键作用，尤其是转基因小鼠，为基因功能的探索和人类疾病的模拟立下了汗马功劳。然而，小鼠模型与人类在生理和代谢功能上存在着较大差异，就像用一把不太合适的钥匙试图打开人类疾病的大门，很难精准地重现人类疾病的真实病理。

非人灵长类动物，作为人类的近亲，与人类在遗传上高度相似，成为了研究人类生物学和疾病的宝贵实验模型。食蟹猴（cynomolgus monkeys）更是其中的佼佼者，广泛应用于神经科学、传染病研究、药物开发的安全性评估以及临床前研究等多个重要领域。

此前，研究人员尝试利用慢病毒载体法（lentiviral vector method）生成转基因食蟹猴，但这一方法存在诸多局限。一方面，它需要特殊的设备、设施和专业技能，这就像是给研究设置了一道道高高的门槛，限制了其广泛应用；另一方面，该方法在筛选转基因整合、插入基因长度以及遗传镶嵌性（genetic mosaicism）等方面存在问题，特别是在胚胎移植前的筛选环节，常常因为慢病毒生产过程中产生的荧光碎片干扰，导致难以准确评估转基因的表达，使得一些实验猴在出生后并未呈现出预期的荧光，这不仅浪费了大量的资源，也在伦理层面引发了争议。

为了突破这些困境，来自日本滋贺医科大学动物生命科学研究中心（Research Center for Animal Life Science, Shiga University of Medical Science）和京都大学等机构的研究人员，开展了一项具有开创性的研究。他们另辟蹊径，采用 piggyBac 转座子系统，试图建立一种全新的非病毒方法来生成转基因食蟹猴。这项研究成果发表在《Nature Communications》上，为转基因非人灵长类动物的研究开辟了新的道路。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是胞质内单精子注射（ICSI）技术，该技术用于获取猴胚胎，解决了猴胚胎获取的难题；二是基因组编辑技术，通过 piggyBac 转座子系统对食蟹猴的基因组进行精准编辑；三是多种检测技术，如基因组聚合酶链反应（PCR）、定量逆转录 PCR（quantitative RT-PCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot analysis）、液滴数字 PCR（ddPCR）、免疫荧光染色（immunofluorescence staining）等，这些技术帮助研究人员全面、深入地检测转基因的表达、插入位点以及相关的分子机制。

下面让我们详细了解一下这项研究的主要结果：

1. 确定 piggyBac 与精子共注射的最佳条件：由于小鼠和猴在获取胚胎的方式上存在差异，猴主要采用 ICSI 方法获取胚胎。研究人员推测在 ICSI 过程中共注射 piggyBac 成分可能更有利于生成转基因猴。为此，他们首先在小鼠中进行实验，将 piggyBac 成分与精子共注射到 MII 期卵母细胞中，并与原核注射（PN injection）方法进行比较。通过对不同浓度 piggyBac 载体的测试，研究人员发现，对于 PN 注射，5 ng/μL 是最佳浓度；而对于共注射，10 ng/μL 是最佳浓度。
2. 利用共注射方法生成转基因小鼠：在确定最佳条件后，研究人员将 10 ng/μL 的 piggyBac 载体和 PBase mRNA 与精子共注射到小鼠 MII 期卵母细胞中。结果显示，共注射能够成功生成转基因小鼠，并且在胚胎移植前进行评估有助于高效获得转基因小鼠。F1 小鼠的转基因传递率达到了 72.2%，F2 代胚胎也表现出较高的荧光阳性率，这充分证明了 piggyBac 系统在生成转基因品系方面的可靠性和实用性。
3. 利用共注射方法生成转基因猴：研究人员将共注射方法应用于猴的实验中，同样发现 10 ng/μL 是共注射的最佳浓度。他们用最佳浓度共注射猴 MII 期卵母细胞和精子，成功获得了转基因胚胎。在 34 个囊胚中，32 个胚胎的膜 tdTomato 呈阳性。对部分胚胎进行性别鉴定后，将 20 个胚胎移植到代孕母猴体内，最终成功获得了 4 只猴子，其中 1 只雄性猴子（#1）在胎盘和全身都表现出 tdTomato 和 GFP 的荧光，2 只雌性猴子（#2 和 #3）以及 1 只雄性死胎猴子（#4）也检测到了不同程度的荧光。
4. 检测转基因猴组织中的转基因：不幸的是，雄性猴子（#1）因母猴疏忽死亡。研究人员对其和死胎猴子（#4）的器官进行了全面检测，通过基因组 PCR、定量 RT-PCR 和 Western blot 分析等方法，发现所有分析的组织中都存在转基因，且各组织中 GFP 的表达水平存在差异。对于存活的猴子（#2 和 #3），研究人员采用 ddPCR 技术进行检测，结果表明不同猴子的不同组织中转基因的存在情况和表达水平各不相同。此外，通过反向 PCR（inverse PCR）和下一代测序（NGS）分析，研究人员确定了转基因的插入位点，发现大多数插入位点位于基因间区域、内含子等，且不同猴子和组织之间的插入位点存在差异。
5. 免疫荧光分析转基因表达：虽然 RT-PCR 和 Western blotting 分析证实了转基因在所有检测组织中的表达，但低倍荧光成像在某些器官中未能清晰显示信号。为了进一步探究转基因在单细胞水平的表达情况，研究人员对猴子 #1 的组织样本进行了免疫染色和高倍成像分析。结果发现，转基因在所有检测组织中均有表达，且在不同组织的特异性细胞中表达，不同组织中 GFP 的表达率和强度存在差异，同时还观察到了转基因表达的镶嵌性（mosaicism）。通过对成纤维细胞的研究发现，这种镶嵌性可能是由遗传镶嵌性导致的，并且与 DNA 甲基化无关，可能涉及其他表观遗传调控机制。
6. 猴中转基因的生殖系整合：研究人员对转基因猴 #1 的睾丸进行了免疫荧光染色分析，发现超过 80% 的 DDX4 阳性生殖细胞表达 GFP，这表明转基因成功整合到了生殖细胞中，为转基因的遗传传递提供了重要证据。

在讨论部分，研究人员对整个研究进行了深入总结和思考。他们成功地利用非病毒 piggyBac 转座子系统生成了转基因食蟹猴，这一成果具有重要的意义。通过确定胚胎性别和基因分型，研究人员认为该方法在其他基因编辑胚胎的植入前基因分型中也具有潜在的应用价值。研究还发现，转基因插入位点和数量可能与猴子的生存情况相关，这为进一步研究转基因的安全性提供了重要线索。此外，研究人员还对转基因表达的组织特异性差异、镶嵌性以及与 DNA 甲基化的关系进行了探讨，发现 CAG 启动子可能是导致组织特异性表达差异的原因，而转基因镶嵌性不能完全用 DNA 甲基化来解释，可能涉及其他复杂的调控机制。与慢病毒载体相比，piggyBac 转座子系统具有诸多优势，如降低生物安全风险、操作简单等，为转基因动物的研究提供了更可靠的选择。然而，研究也存在一些局限性，如 piggyBac 系统的随机整合可能导致插入突变或胚胎毒性，启动子的选择对转基因表达水平有显著影响，目前的敲入方法效率仍有待提高等。

总的来说，这项研究成功建立了一种非病毒方法来生成转基因食蟹猴，为生物医学研究提供了一种新的实验模型，有助于深入了解人类生物学和疾病机制。同时，研究结果也为转基因技术的进一步发展和优化提供了重要的参考，为未来的研究指明了方向。虽然目前还存在一些问题需要解决，但研究人员的努力和突破为该领域的发展带来了新的希望，相信在未来，转基因非人灵长类动物的研究将取得更加丰硕的成果。